マウスの糖尿病関連死からの網膜血管系の保護を検出するためのアッセイ

すべての動物実験は、イリノイ大学シカゴ校の動物管理および施設バイオセーフティ局によって承認されました。生後7週齢の雄のC57/BL6/Jマウスを、病原体のない環境下で12時間の明暗サイクルでグループケージに収容し、餌と水を無料で提供しました。マウスはCO2 窒息によって安楽死させられ、眼球は直ちに摘出され、処理された18。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。研究に必要な必須ツールを 図1に示します。 1. 死を誘発する侮辱の配信 TBH(ex vivo)で酸化ストレスを実行します。施設で承認されたプロトコルに従ってマウスを安楽死させ、眼球を摘出します18 (図2A)。 5 mM Tert-ブチルヒドロペルオキシド(TBH)の有無にかかわらず、DMEM + 1% BSAを含む24ウェルプレートの個々のウェルに眼球を直接入れます( 材料表を参照)。37°Cで1時間インキュベートします。 ポジティブコントロールサンプルをDNase(50 U/100 μL)で10分間処理し、DNAを断片化します。注:TBH(酸化ストレスを誘発する薬剤)の用量は、単離された網膜血管内の細胞死の容易に検出可能で最大以下のレベルを誘発するように選択されました18。 10%緩衝ホルマリンで一晩(最低16時間)眼球を固定します。 サイトカインカクテルを使用して炎症を誘発します(in vivo)。100 mg / kgケタミンと5 mg / kgキシラジンの腹腔内注射でマウスを麻酔します。. カスタマイズされた33 G針( 材料表を参照)を使用して、サイトカインカクテル1 μL/眼を硝子体に注入します。注射部位は辺縁部から2〜3mmです(図2B)。注:サイトカインカクテルには、1 μg/mLのTNF-α、1 μg/mLのIL-1β、および1500 U/μLのIFN-γ18 が1:1:1の比率で含まれています( 材料表を参照)。 注射の24時間後、マウスを安楽死させ(施設で承認されたプロトコルに従って)、眼球を摘出し、10%緩衝ホルマリンで一晩固定します。注:実験は、固定後に最大1週間一時停止し、後で再開することができます。 2.網膜の分離 眼球を切り開きます。まっすぐな鉗子を使用して視神経をそっとつかみます(図2C)。もう一方の手でマイクロナイフを持ち、辺縁部の後方2〜3mmを切開します。 マイクロナイフからマイクロハサミに切り替えて、眼球を視神経と一緒に回転させながら、眼球を2つに切るまで輪部と平行に切断します。 水晶体を含む眼の前半分を捨てます(図2C)。 強膜を取り除きます。まっすぐな鉗子を使用して、強膜を網膜から1〜3mmそっと持ち上げます。 マイクロハサミを使用して、視神経に向かう途中の強膜に2つの橈骨切り込みを入れます。下にある網膜を切らないでください。 湾曲した鉗子を使用して強膜フラップをつかみ、網膜から引き剥がします。RPE層は強膜とともに剥がれ落ちます。 網膜を洗います。マイクロスパチュラを使用して、単離された網膜を、二重蒸留水で満たされた24ウェル皿内のウェルに移します。 室温で中程度の速度で皿を静かに振ってください。30分ごとに水を1時間、少なくとも4〜5回交換し、一晩放置します。 3.網膜血管系の分離 消化:二重蒸留水を800 μLのYLトリプシン溶液(0.1 Mトリスバッファー(pH 7.8)中の3%トリプシン)と交換します。37°Cで4時間15分19 秒間、穏やかに振とうしながらインキュベートします(図2D)。注意: 急激な振とうは血管系を損傷する可能性があるため、避けてください。 転写:ガラス転写ピペットの広端をYLトリプシン溶液に浸し、糸くずの出ない二重蒸留水を入れた35mmシャーレに網膜を移します。 外側の核膜(光受容体)を除去します(図2E)。網膜の半球を下向きに反転させます。まっすぐな一本毛のブラシを使用して、網膜を皿の底にそっと押し込みます。 ループブラシを使用して、網膜の視細胞をやさしく払い落とします。ブラシストロークは、視神経から網膜の末梢に向かって適用されます。視細胞は、血管によって網膜の残りの部分に固定されていないため、大きなシート状に剥離する可能性があります。 200μLのピペットを使用して、神経組織のシートを回収して廃棄します。 硝子体を取り除きます。網膜の半球を上向きに反転させます。一対の湾曲した鉗子(A)を使用して、解剖顕微鏡で硝子体をできるだけ把握します。注:硝子体は、視神経または網膜に付着した透明な組織のシートのように見えます。 別の湾曲した鉗子(B)を使用して、視神経をつなぐ硝子体の端をつかみます。鉗子Aを鉗子Bから引き離して硝子体を取り除きます。 硝子体を捨てます。硝子体の残骸を調べ、この手順を繰り返して、残留物が次のステップを妨げるため、すべての硝子体を取り除きます。 残りの神経組織とグリア組織を取り除きます(図2F)。網膜の半球をひっくり返して、再び下向きにします。もう一度、まっすぐなブラシを使用して、網膜を皿の底にそっと押し付けます(髪の毛の先端は使用しないでください)。 ループブラシを使用して、視神経頭から末梢に向かって血管系を優しくブラッシングし、残りの神経組織20を除去します。 まっすぐなブラシで網膜をゆっくりと回転させ、ループブラシを使用して、血管網が十分に洗浄されるまで、網膜血管系上の神経組織の小さな塊をすべて除去します(図2G、H)。 4. 単離された網膜血管系を顕微鏡スライドに取り付ける 顕微鏡スライドを配置します。清潔な取り付けカセット( 材料表を参照)を解剖顕微鏡の下に置きます。カセットに二重蒸留水を入れます。 解剖顕微鏡の下で黒い背景を使用してコントラストを生成し、照らされた透明な血管系を確認します。 鉗子を使用して、清潔でラベルの付いた顕微鏡スライドを取り付けカセットの底部に配置します。 網膜血管系を移します。ガラストランスファーピペットの広い方の端をYLトリプシン溶液に浸します。 洗浄した網膜血管系を移し、血管系をマウントカセット内および顕微鏡スライドの上の二重蒸留水に静かに取り除きます。 網膜血管系をマウントします。注:血管系が顕微鏡スライドの上に浮いている間、孤立した血管系は通常のボウル形状になります。ループブラシを使用して網膜の半球を上向きに反転させ、血管系をスライドガラスにそっと押し下げてから、髪の毛を使用して開いた血管系をスライドの中央に貼り付けます。血管系は、スライドが触れるときにスライドにくっつく必要があります。 お椀型の網膜血管を視神経から末梢にブラッシングして血管系を平らに取り付けます。 血管系がスライドに完全にくっつくまで、あらゆる方向にブラッシングを繰り返します。 網膜血管系を風乾します。網膜血管系全体がスライドに付着したら、片方の端をそっと持ち上げるか、カセットの角でゆっくりと水を抜いて電流を最小限に抑え、スライドを水から取り出します(図2I)。注:血管系は、風乾するとすぐに見えるようになります(図2J)。 スライドの裏側にある網膜血管系の周囲にマーカーペンで印を付けます。 一時停止せずにサンプルの染色に進みます。 5. TUNEL染色による死亡検出 注:この手順の詳細については、Zheng et al.21を参照してください。孤立した網膜血管における虚血+/-oxストレス誘発アポトーシス体の代表的な画像を 図3に示します。 単離された血管系をPBSで再水和します。PBSで3回すすぎ、PBS中の1% Triton X-100と氷上で2分間インキュベートし、単離された血管系を透過させます。 スライドをPBSで2回すすぎ、残留したTriton X-100を取り除きます。サンプルの周囲を乾燥させます。 50 μLのTUNEL反応混合物( 材料表を参照)をサンプルに加えます。スライドを加湿雰囲気中で、暗所で37°Cで60分間インキュベートします。 スライドをPBSで3回すすぎ、TUNEL反応混合物を除去します。サンプルの周囲を乾燥させます。 DAPI封入剤を一滴加えて核をDAPIで染色し、カバーガラスでサンプルをマウントします。暗所で4°Cで保管してください。注:プロトコルは、画像をキャプチャする前に最大1週間一時停止できます。 得られた血管系を共焦点蛍光顕微鏡で撮影します( 材料表を参照)。視神経を取り巻く遠末梢にある6〜8個のランダムに選択されたフィールドをキャプチャします(図4)。注:単離された網膜血管内のサイトカイン誘導アポトーシス体の代表的な画像を 図5に示します。 結果を分析します。ex vivoでTBH処理したサンプルの場合は、次の手順を実行します。画像Jを用いて、各視野のアポトーシス小体(TUNEL/DAPI二重陽性種)の数を数えます( 材料表参照)。単一サンプルのすべてのフィールドにおけるアポトーシス体の平均を集計します。 無作為に選択された非DMサンプルとDMサンプルのペア間のアポトーシス小体数の倍数変化を計算します。 両側スチューデントのt検定18を使用して、統計的に有意な差があるかどうかを判断します。注:コントロールサンプルと実験サンプル(非DMおよびDM)は、同じ方法で行った場合でも、TUNEL染色の程度が異なる可能性があるため、同じ機会に染色してください。経験豊富なユーザーは、1日あたり最大10個の網膜を洗浄して取り付けることができるため、このプロトコルを開始する前に、同数の対照網膜と実験網膜を処理することを計画してください。 in vivoで、サイトカインカクテル処理したサンプルについては、以下のステップを行う。網膜血管系全体のアポトーシス小体(TUNEL / DAPI二重陽性種)の数を手動でカウントします。 無作為に選択された非DMサンプルとDMサンプルのペア間のアポトーシス小体数の倍数変化を計算します。 両側スチューデントのt検定を使用して、統計的に有意な差があるかどうかを判断します。