הערכת ציטוטוקסיות של מטבוליטים של חומרי הדברה טריאזולים טיפוסיים בצמחים
Summary
הפרוטוקול מתאר שיטה חדשה להערכת ציטוטוקסיות אינטגרלית של מטבוליטים של חומרי הדברה טריאזולים בצמחים.
Abstract
מזהמים אורגניים שונים שוחררו לסביבה בגלל פעילויות אנתרופוגניות. מזהמים אלה יכולים להיקלט על ידי צמחי יבול, ולגרום לאיומים פוטנציאליים על המערכת האקולוגית ובריאות האדם לאורך שרשרת המזון. הביוטרנספורמציה של מזהמים בצמחים מייצרת מספר מטבוליטים שעשויים להיות רעילים יותר מתרכובות האב שלהם, מה שמרמז שיש לקחת בחשבון את המטבוליטים במהלך הערכת הרעילות. עם זאת, מטבוליטים של מזהמים בצמחים הם מורכבים ביותר, מה שמקשה על קבלת מידע טוקסיקולוגי מקיף של כל המטבוליטים. מחקר זה הציע אסטרטגיה להערכת ציטוטוקסיות אינטגרלית של מטבוליטים מזהמים בצמחים על ידי התייחסות אליהם כמכלול במהלך בדיקות טוקסיקולוגיות. חומרי הדברה Triazole, סוג של קוטלי פטריות רחבי-טווח, יושמו באופן נרחב בייצור חקלאי. זיהום השאריות שלהם בשטחים חקלאיים משך תשומת לב הולכת וגוברת. לפיכך, ארבעה חומרי הדברה triazole, כולל flusilazole, diniconazole, tebuconazole, ו propiconazole, נבחרו כמזהמים שנבדקו. המטבוליטים נוצרו על ידי טיפול של יבלת גזר עם חומרי הדברה triazole נבדק. לאחר טיפול של 72 שעות, מטבוליטים של חומרי הדברה יבלת גזר חולצו, ואחריו בדיקות טוקסיקולוגיות באמצעות קו התאים Caco-2. התוצאות הראו כי מטבוליטים של חומרי הדברה שנבדקו ביבלת גזר לא עיכבו באופן משמעותי את הכדאיות של תאי Caco-2 (P>0.05), ולא הוכיחו ציטוטוקסיות של מטבוליטים של חומרי הדברה. שיטה מוצעת זו פותחת אפיק חדש להערכת ציטוטוקסיות של מטבוליטים מזהמים בצמחים, אשר צפוי לספק נתונים בעלי ערך להערכת רעילות מדויקת.
Introduction
צמחי יבול הגדלים בשטחים חקלאיים עלולים להיחשף למזהמים אורגניים שונים שמקורם בפעילות אנתרופוגנית 1,2. המזהמים יכולים להיקלט על ידי צמחים, מה שגורם לאיומים נוספים על המערכת האקולוגית ובריאות האדם באמצעות שרשראות מזון 3,4. הקסנוביוטיקה בצמחים עוברת ככל הנראה סדרה של ביוטרנספורמציה, כגון מטבוליזם שלב I ו-II5, ומייצרת מספר מטבוליטים. על פי תפיסת הכבד הירוק בצמחים, חילוף החומרים של צמחים יכול להפחית את הרעילות של קסנוביוטיקה 6,7. עם זאת, התגלה כי הרעילות של מטבוליטים מסוימים עשויה להיות גבוהה יותר מזו של הוריהם. לדוגמה, המוצר debrominated של tetrabromobisphenol A (TBBPA) ואת המוצר O-methylated של bisphenol A (BPA) הוכחו להיות הרבה יותר רעיל מאשר הוריהם 8,9, ואת debromination ו O-methylation מהווים את מסלולי חילוף החומרים שלב I העיקריים בצמחים. לפיכך, הערכת הרעילות המבוססת אך ורק על הורים מזהמים בצמחים אינה מדויקת, בעוד שיש לקחת בחשבון את המטבוליטים המתאימים.
המטבוליטים של קסנוביוטיקה בצמחים מורכבים ביותר10,11, מה שמקשה על זיהוי מקיף והפרדתם. בנוסף, ניתן להשיג רק כמה סטנדרטים של מטבוליטים מזוהים. לפיכך, נתונים טוקסיקולוגיים של כל המטבוליטים אינם זמינים, מה שמעכב הערכת רעילות מקיפה. מחקר זה הציע אסטרטגיה להערכת הרעילות האינטגרלית של מטבוליטים מזהמים בצמחים על ידי התייחסות אליהם כמכלול במהלך בדיקות טוקסיקולוגיות, תוך מתן נתונים חדשים להערכת רעילות מדויקת של מזהמים בצמחים. המחקר הקודם שלנו גילה כי תרבית יבלות צמחיות פותחת אפיק פשוט ויעיל להשגת מטבוליטים של קסנוביוטיקה בצמחים12. בהתאם לכך, תרבית יבלות צמחיות שימשה במחקר זה ליצירת מטבוליטים של מזהמים בצמחים, ולאחר מכן מיצוי כימי ובדיקות טוקסיקולוגיות באמצעות קו תאים אנושי. מערכת העיכול היא אחד מאיברי המטרה הישירים של קסנוביוטיקה שנחשפו לבעלי חיים ולבני אדם. קו התאים Caco-2 הוכח כמודל הטוב ביותר לחקר התנהגויות המעי והרעילות של קסנוביוטיקה במבחנה 13,14,15. לפיכך, מודל התא Caco-2 נבחר במחקר זה.
חומרי הדברה Triazole, קבוצה של קוטלי פטריות רחבי טווח, יושמו באופן נרחב בייצור חקלאי16. זיהום השאריות שלהם בשטחים חקלאיים משך תשומת לב גוברת17,18. כאן, ארבעה חומרי הדברה נפוצים של טריאזול, כולל flusilazole, diniconazole, tebuconazole ו- propiconazole, נבחרו כמזהמים האופייניים. גזר נבחר במחקר זה כצמח המייצג של ירקות טריים ומוכנים לאכילה. יבלת גזר נחשפה בתחילה לחומרי ההדברה שנבדקו בריכוז של 100 מ”ג/ליטר. לאחר חשיפה של 72 שעות, המטבוליטים חולצו כדי להעריך את ציטוטוקסיות באמצעות קו תאים Caco-2. שיטה זו יכולה להיות מורחבת בקלות כדי להעריך את ציטוטוקסיות אינטגרלית של מטבוליטים של סוגים אחרים של מזהמים בצמחים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה פותח כדי להעריך את ציטוטוקסיות אינטגרלית של מטבוליטים של חומרי הדברה triazole בצמחים על ידי שילוב של יבלות צמחיות ומודלים של תאים אנושיים. השלבים הקריטיים לפרוטוקול המוצע הזה הם תרבית של יבלת צמחית ותא Caco-2. החלק הקשה ביותר והעצות היחסיות לתרבית יבלות צמחים ניתנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21976160) ופרויקט מחקר יישומי טכנולוגיית רווחה ציבורית במחוז ג’ג’יאנג (LGF21B070006).
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500 mL | |
| 96-well plate | Thermo Fisher | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| Caco-2 cells | Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd. | ||
| CCK8 reagents | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China | G021-1-3 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| CO2 incubator | Labtrip | HWJ-3-160 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio Life Sciences | D8371 | |
| Diniconazole, 98.7% | J&K Scientific | 83657-24-3 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Solarbio Life Sciences | 11965-500 mL | |
| electronic balance | Shanghai Precision Instrument Co., Ltd | FA1004B | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Tecan | Infinite M200 | |
| Flusilazole, 98.5% | J&K Scientific | 85509-19-9 | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Inverted microscope | Leica Biosystems | DMi1 | |
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| Nitrogen blowing concentrator | AOSHENG | MD200-2 | |
| PBS | Solarbio Life Sciences | P1022-500 mL | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio Life Sciences | P1400-100 mL | |
| Propiconazole, 100% | J&K Scientific | 60207-90-1 | |
| Research plus | Eppendorf | 10-1000 μL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | THZ-98AB | |
| Tebuconazole, 100% | J&K Scientific | 107534-96-3 | |
| Trypsin-EDTA solution | Solarbio Life Sciences | T1300-100 mL | |
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized super clean bench | AIRTECH | ||
| Vortex instrument | Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd | BV-1010 |
References
- Fan, Y., et al. Uptake of halogenated organic compounds (HOCs) into peanut and corn during the whole life cycle grown in an agricultural field. Environ Pollut. 263, 114400 (2020).
- Wu, Q., et al. Trace metals in e-waste lead to serious health risk through consumption of rice growing near an abandoned e-waste recycling site: Comparisons with PBDEs and AHFRs. Environ Pollut. 247, 46-54 (2019).
- Liu, A. F., et al. Tetrabromobisphenol-A/S and nine novel analogs in biological samples from the Chinese Bohai Sea: Implications for trophic transfer. Environ Sci Technol. 50 (8), 4203-4211 (2016).
- Awasthi, A. K., Zeng, X., Li, J. Environmental pollution of electronic waste recycling in India: A critical review. Environ Pollut. 211, 259-270 (2016).
- Zhang, Q., et al. Plant accumulation and transformation of brominated and organophosphate flame retardants: A review. Environ Pollut. 288, 117742 (2021).
- Sandermann, H. Higher plant metabolism of xenobiotics: the ‘green liver’ concept. Pharmacogenetics. 4, 225-241 (1994).
- Zhang, J. J., Yang, H. Metabolism and detoxification of pesticides in plants. Sci Total Environ. 790, 148034 (2021).
- Debenest, T., et al. Ecotoxicity of a brominated flame retardant (tetrabromobisphenol A) and its derivatives to aquatic organisms. Comp Biochem Phys C. 152 (4), 407-412 (2010).
- McCormick, J. M., Van Es, T., Cooper, K. R., White, L. A., Haggblom, M. M. Microbially mediated O-methylation of bisphenol A results in metabolites with increased toxicity to the developing zebrafish (Danio rerio) embryo. Environ Sci Technol. 45 (15), 6567-6574 (2011).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environ Sci Technol. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environ Sci Technol. 53 (15), 8805-8812 (2019).
- Wu, J., et al. Elucidating the metabolism of 2,4-Dibromophenol in plants. J Vis Exp. (192), e65089 (2023).
- Zucco, F., et al. An Inter-laboratory study to evaluate the effects of medium composition on the differentiation and barrier function of Caco-2 cell lines. Atla-Altern Lab Anim. 33, 603-618 (2005).
- Eisenbrand, G., et al. Methods of in vitro toxicology. Food Chem Toxicol. 40, 193-236 (2002).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21, 1-26 (2005).
- Li, H., et al. Uptake, translocation, and subcellular distribution of three triazole pesticides in rice. Environ Sci Pollut Res. 29 (17), 25581-25590 (2022).
- Satapute, P., Kamble, M. V., Adhikari, S. S., Jogaiah, S. Influence of triazole pesticides on tillage soil microbial populations and metabolic changes. Sci Total Environ. 651, 2334-2344 (2019).
- Xu, Y., et al. A possible but unrecognized risk of acceptable daily intake dose triazole pesticides exposure-bile acid disturbance induced pharmacokinetic changes of oral medication. Chemosphere. 322, 138209 (2023).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
