تقييم السمية الخلوية لمستقلبات مبيدات الآفات التريازول النموذجية في النباتات
Summary
يصف البروتوكول طريقة جديدة لتقييم السمية الخلوية المتكاملة لمستقلبات مبيدات الآفات التريازول في النباتات.
Abstract
تم إطلاق ملوثات عضوية مختلفة في البيئة بسبب الأنشطة البشرية. يمكن أن تمتص نباتات المحاصيل هذه الملوثات ، مما يتسبب في تهديدات محتملة للنظام البيئي وصحة الإنسان في جميع أنحاء السلسلة الغذائية. يولد التحول الأحيائي للملوثات في النباتات عددا من المستقلبات التي قد تكون أكثر سمية من مركباتها الأصلية ، مما يعني أنه ينبغي أخذ المستقلبات في الاعتبار أثناء تقييم السمية. ومع ذلك ، فإن مستقلبات الملوثات في النباتات معقدة للغاية ، مما يجعل من الصعب الحصول على المعلومات السمية لجميع الأيضات بشكل شامل. اقترحت هذه الدراسة استراتيجية لتقييم السمية الخلوية المتكاملة لمستقلبات الملوثات في النباتات من خلال معالجتها ككل أثناء الاختبارات السمية. تم تطبيق مبيدات الآفات Triazole ، وهي فئة من مبيدات الفطريات واسعة الطيف ، على نطاق واسع في الإنتاج الزراعي. وقد اجتذب تلوث بقاياها في الأراضي الزراعية اهتماما متزايدا. ومن ثم ، تم اختيار أربعة مبيدات آفات تريازول ، بما في ذلك فلوسيلازول ، ودينيكونازول ، وتيبوكونازول ، وبروبيكونازول ، كملوثات تم اختبارها. تم إنشاء المستقلبات عن طريق معالجة الكالس الجزري بمبيدات الآفات التريازول المختبرة. بعد معالجة 72 ساعة ، تم استخراج مستقلبات المبيدات الحشرية في الكالس الجزري ، تليها اختبارات السمية باستخدام خط خلية Caco-2. أظهرت النتائج أن مستقلبات المبيدات المختبرة في الكالس الجزري لم تمنع بشكل كبير صلاحية خلايا Caco-2 (P>0.05) ، مما يدل على عدم وجود سمية خلوية لمستقلبات المبيدات. تفتح هذه الطريقة المقترحة طريقا جديدا لتقييم السمية الخلوية لمستقلبات الملوثات في النباتات ، والتي من المتوقع أن توفر بيانات قيمة لتقييم السمية بدقة.
Introduction
قد تتعرض نباتات المحاصيل التي تنمو في الأراضي الزراعية لملوثات عضوية مختلفة ناشئة عن الأنشطة البشرية 1,2. يمكن أن تمتص النباتات الملوثات ، مما يتسبب في مزيد من التهديدات للنظام البيئي وصحة الإنسان من خلال سلاسل الغذاء 3,4. من المحتمل أن يخضع xenobiotics في النباتات لسلسلة من التحول الحيوي ، مثل المرحلة الأولى والثانية من التمثيل الغذائي5 ، مما يولد عددا من الأيضات. وفقا لمفهوم الكبد الأخضر في النباتات ، يمكن أن يقلل التمثيل الغذائي للنبات من سمية xenobiotics 6,7. ومع ذلك ، فقد تم الكشف عن أن سمية بعض المستقلبات قد تكون أعلى من سمية والديهم. فعلى سبيل المثال، ثبت أن المنتج غير المشبع بالبرومة من رباعي البروم ثنائي الفينول ألف (TBBPA) والمنتج الميثيلي O للثنائي الفينول ألف (BPA) أكثر سمية بكثير من والديهما8، 9، وتشكل إزالة البرومة وميثيل O مسارات التمثيل الغذائي الرئيسية للمرحلة الأولى في النباتات. وبالتالي ، فإن تقييم السمية الذي يعتمد فقط على الوالدين الملوثين في النباتات ليس دقيقا ، في حين يجب أن تؤخذ المستقلبات المقابلة في الاعتبار.
مستقلبات xenobiotics في النباتات معقدة للغاية10,11 ، مما يجعل من الصعب تحديدها وفصلها بشكل شامل. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن الحصول إلا على عدد قليل من معايير الأيضات المحددة. ومن ثم، فإن البيانات السمية لجميع المستقلبات غير متاحة، مما يعوق إجراء تقييم شامل للسمية. اقترحت هذه الدراسة استراتيجية لتقييم السمية المتكاملة لمستقلبات الملوثات في النباتات من خلال معالجتها ككل أثناء الاختبارات السمية ، مما يوفر بيانات جديدة لتقييم سمية الملوثات في النباتات. كشفت دراستنا السابقة أن ثقافة الكالس النباتية تفتح طريقا بسيطا وفعالا للحصول على مستقلبات xenobiotics في النباتات12. وبناء على ذلك ، تم استخدام ثقافة الكالس النباتية في هذه الدراسة لتوليد مستقلبات الملوثات في النباتات ، تليها الاستخراج الكيميائي والاختبارات السمية باستخدام خط الخلايا البشرية. الجهاز المعوي هو أحد الأعضاء المستهدفة مباشرة للأجانب المعرضين للحيوانات والبشر. أثبت خط خلايا Caco-2 أنه أفضل نموذج للتحقيق في السلوكيات المعوية وسمية xenobiotics في المختبر13،14،15. وهكذا ، تم اختيار نموذج خلية Caco-2 في هذه الدراسة.
تم تطبيق مبيدات الآفات Triazole ، وهي فئة من مبيدات الفطريات واسعة الطيف ، على نطاق واسع في الإنتاج الزراعي16. وقد جذب تلوث بقاياها في الأراضي الزراعية اهتماما متزايدا17,18. هنا ، تم اختيار أربعة مبيدات حشرية شائعة الاستخدام ، بما في ذلك فلوسيلازول ، دينيكونازول ، تيبوكونازول ، وبروبيكونازول ، كملوثات نموذجية. تم اختيار الجزر في هذه الدراسة كنبات تمثيلي للخضروات الطازجة الجاهزة للأكل. تعرض الكالس الجزري في البداية لمبيدات الآفات المختبرة بتركيز 100 مجم / لتر. بعد التعرض لمدة 72 ساعة ، تم استخراج المستقلبات لتقييم السمية الخلوية باستخدام خط خلية Caco-2. يمكن توسيع هذه الطريقة بسهولة لتقييم السمية الخلوية المتكاملة لمستقلبات الأنواع الأخرى من الملوثات في النباتات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير هذا البروتوكول لتقييم السمية الخلوية المتكاملة لمستقلبات مبيدات الآفات التريازول في النباتات من خلال الجمع بين الكالس النباتي ونماذج الخلايا البشرية. الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول المقترح هي زراعة الكالس النباتي وخلية Caco-2. تم تقديم الجزء الأكثر صعوبة والن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21976160) ومشروع أبحاث تطبيق تكنولوجيا الرفاهية العامة بمقاطعة تشجيانغ (LGF21B070006).
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500 mL | |
| 96-well plate | Thermo Fisher | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| Caco-2 cells | Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd. | ||
| CCK8 reagents | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China | G021-1-3 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| CO2 incubator | Labtrip | HWJ-3-160 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio Life Sciences | D8371 | |
| Diniconazole, 98.7% | J&K Scientific | 83657-24-3 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Solarbio Life Sciences | 11965-500 mL | |
| electronic balance | Shanghai Precision Instrument Co., Ltd | FA1004B | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Tecan | Infinite M200 | |
| Flusilazole, 98.5% | J&K Scientific | 85509-19-9 | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Inverted microscope | Leica Biosystems | DMi1 | |
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| Nitrogen blowing concentrator | AOSHENG | MD200-2 | |
| PBS | Solarbio Life Sciences | P1022-500 mL | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio Life Sciences | P1400-100 mL | |
| Propiconazole, 100% | J&K Scientific | 60207-90-1 | |
| Research plus | Eppendorf | 10-1000 μL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | THZ-98AB | |
| Tebuconazole, 100% | J&K Scientific | 107534-96-3 | |
| Trypsin-EDTA solution | Solarbio Life Sciences | T1300-100 mL | |
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized super clean bench | AIRTECH | ||
| Vortex instrument | Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd | BV-1010 |
References
- Fan, Y., et al. Uptake of halogenated organic compounds (HOCs) into peanut and corn during the whole life cycle grown in an agricultural field. Environ Pollut. 263, 114400 (2020).
- Wu, Q., et al. Trace metals in e-waste lead to serious health risk through consumption of rice growing near an abandoned e-waste recycling site: Comparisons with PBDEs and AHFRs. Environ Pollut. 247, 46-54 (2019).
- Liu, A. F., et al. Tetrabromobisphenol-A/S and nine novel analogs in biological samples from the Chinese Bohai Sea: Implications for trophic transfer. Environ Sci Technol. 50 (8), 4203-4211 (2016).
- Awasthi, A. K., Zeng, X., Li, J. Environmental pollution of electronic waste recycling in India: A critical review. Environ Pollut. 211, 259-270 (2016).
- Zhang, Q., et al. Plant accumulation and transformation of brominated and organophosphate flame retardants: A review. Environ Pollut. 288, 117742 (2021).
- Sandermann, H. Higher plant metabolism of xenobiotics: the ‘green liver’ concept. Pharmacogenetics. 4, 225-241 (1994).
- Zhang, J. J., Yang, H. Metabolism and detoxification of pesticides in plants. Sci Total Environ. 790, 148034 (2021).
- Debenest, T., et al. Ecotoxicity of a brominated flame retardant (tetrabromobisphenol A) and its derivatives to aquatic organisms. Comp Biochem Phys C. 152 (4), 407-412 (2010).
- McCormick, J. M., Van Es, T., Cooper, K. R., White, L. A., Haggblom, M. M. Microbially mediated O-methylation of bisphenol A results in metabolites with increased toxicity to the developing zebrafish (Danio rerio) embryo. Environ Sci Technol. 45 (15), 6567-6574 (2011).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environ Sci Technol. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environ Sci Technol. 53 (15), 8805-8812 (2019).
- Wu, J., et al. Elucidating the metabolism of 2,4-Dibromophenol in plants. J Vis Exp. (192), e65089 (2023).
- Zucco, F., et al. An Inter-laboratory study to evaluate the effects of medium composition on the differentiation and barrier function of Caco-2 cell lines. Atla-Altern Lab Anim. 33, 603-618 (2005).
- Eisenbrand, G., et al. Methods of in vitro toxicology. Food Chem Toxicol. 40, 193-236 (2002).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21, 1-26 (2005).
- Li, H., et al. Uptake, translocation, and subcellular distribution of three triazole pesticides in rice. Environ Sci Pollut Res. 29 (17), 25581-25590 (2022).
- Satapute, P., Kamble, M. V., Adhikari, S. S., Jogaiah, S. Influence of triazole pesticides on tillage soil microbial populations and metabolic changes. Sci Total Environ. 651, 2334-2344 (2019).
- Xu, Y., et al. A possible but unrecognized risk of acceptable daily intake dose triazole pesticides exposure-bile acid disturbance induced pharmacokinetic changes of oral medication. Chemosphere. 322, 138209 (2023).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
