Summary

Évaluation de la cytotoxicité des métabolites des pesticides triazoles typiques dans les plantes

Published: December 22, 2023
doi:

Summary

Le protocole décrit une nouvelle méthode pour évaluer la cytotoxicité intégrale des métabolites des pesticides triazolés dans les plantes.

Abstract

Divers polluants organiques ont été rejetés dans l’environnement en raison des activités anthropiques. Ces polluants peuvent être absorbés par les plantes cultivées, ce qui constitue une menace potentielle pour l’écosystème et la santé humaine tout au long de la chaîne alimentaire. La biotransformation des polluants dans les plantes génère un certain nombre de métabolites qui peuvent être plus toxiques que leurs composés parents, ce qui implique que ces métabolites doivent être pris en compte lors de l’évaluation de la toxicité. Cependant, les métabolites des polluants dans les plantes sont extrêmement complexes, ce qui rend difficile l’obtention complète d’informations toxicologiques sur tous les métabolites. Cette étude a proposé une stratégie pour évaluer la cytotoxicité intégrale des métabolites polluants dans les plantes en les traitant dans leur ensemble lors d’essais toxicologiques. Les pesticides à base de triazole, une classe de fongicides à large spectre, ont été largement utilisés dans la production agricole. La pollution par les résidus dans les terres agricoles attire de plus en plus l’attention. Par conséquent, quatre pesticides à base de triazole, à savoir le flusilazole, le diniconazole, le tébuconazole et le propiconazole, ont été sélectionnés comme polluants testés. Les métabolites ont été générés par le traitement des callosités de la carotte avec des pesticides triazoles testés. Après un traitement de 72 h, les métabolites des pesticides dans le cal de carotte ont été extraits, suivis de tests toxicologiques utilisant la lignée cellulaire Caco-2. Les résultats ont montré que les métabolites des pesticides testés dans les callosités de carotte n’inhibaient pas significativement la viabilité des cellules Caco-2 (P>0,05), démontrant l’absence de cytotoxicité des métabolites des pesticides. Cette méthode proposée ouvre une nouvelle voie pour évaluer la cytotoxicité des métabolites polluants dans les plantes, ce qui devrait fournir des données précieuses pour une évaluation précise de la toxicité.

Introduction

Les plantes cultivées qui poussent dans les terres agricoles peuvent être exposées à divers polluants organiques provenant des activités anthropiques 1,2. Les polluants peuvent être absorbés par les plantes, ce qui constitue une menace supplémentaire pour l’écosystème et la santé humaine par le biais des chaînes alimentaires 3,4. Les xénobiotiques des plantes subissent probablement une série de biotransformations, telles que les métabolismes de phase I et II5, générant un certain nombre de métabolites. Selon le concept de foie vert chez les plantes, le métabolisme des plantes peut réduire la toxicité des xénobiotiques 6,7. Cependant, il a été révélé que la toxicité de certains métabolites pourrait être supérieure à celle de leurs parents. Par exemple, il a été prouvé que le produit débromé du tétrabromobisphénol A (TBBPA) et le produit O-méthylé du bisphénol A (BPA) sont beaucoup plus toxiques que leurs parents 8,9, et la débromation et l’O-méthylation constituent les principales voies métaboliques de phase I chez les plantes. Ainsi, l’évaluation de la toxicité basée uniquement sur les parents polluants dans les plantes n’est pas précise, alors que les métabolites correspondants doivent être pris en compte.

Les métabolites des xénobiotiques chez les plantes sont extrêmement complexes 10,11, ce qui rend difficile leur identification et leur séparation complètes. De plus, seuls quelques étalons de métabolites identifiés peuvent être obtenus. Par conséquent, les données toxicologiques de tous les métabolites ne sont pas disponibles, ce qui entrave une évaluation complète de la toxicité. Cette étude a proposé une stratégie pour évaluer la toxicité intégrale des métabolites polluants dans les plantes en les traitant dans leur ensemble lors d’essais toxicologiques, fournissant de nouvelles données pour une évaluation précise de la toxicité des polluants dans les plantes. Notre précédente étude a révélé que la culture de callosités végétales ouvre une voie simple et efficace pour obtenir des métabolites de xénobiotiques dans les plantes12. En conséquence, la culture de callosités végétales a été utilisée dans cette étude pour générer les métabolites des polluants dans les plantes, suivie d’une extraction chimique et de tests toxicologiques utilisant une lignée cellulaire humaine. Le tractus intestinal est l’un des organes cibles directs des xénobiotiques exposés aux animaux et aux humains. La lignée cellulaire Caco-2 s’est avérée être le meilleur modèle pour étudier les comportements intestinaux et la toxicité des xénobiotiques in vitro 13,14,15. Ainsi, le modèle de cellule Caco-2 a été sélectionné dans cette étude.

Les pesticides à base de triazole, une classe de fongicides à large spectre, ont été largement utilisés dans la production agricole16. La pollution par les résidus dans les terres agricoles a attiré de plus en plus d’attention17,18. Ici, quatre pesticides triazolés couramment utilisés, à savoir le flusilazole, le diniconazole, le tébuconazole et le propiconazole, ont été sélectionnés comme polluants typiques. La carotte a été sélectionnée dans cette étude comme plante représentative des légumes frais et prêts à consommer. Le cal de carotte a d’abord été exposé aux pesticides testés à une concentration de 100 mg/L. Après une exposition de 72 h, les métabolites ont été extraits afin d’évaluer la cytotoxicité à l’aide de la lignée cellulaire Caco-2. Cette méthode peut être facilement étendue pour évaluer la cytotoxicité intégrale des métabolites d’autres types de polluants dans les plantes.

Protocol

1. Différenciation du cal de la carotte REMARQUE : Le protocole détaillé de différenciation du cal de la carotte a été décrit dans une étude précédente12. En voici une brève description. Stériliser la surface des graines vernalisées avec de l’éthanol à 75% pendant 20 min puis à 20% deH2O2 pendant 20 min. Lavez-le avec de l’eau distillée au moins 3 fois. Sem…

Representative Results

La figure 1 représente le schéma de la méthode proposée pour la production, l’extraction et l’évaluation de la cytotoxicité des métabolites de pesticides dans les callosités de la carotte. Dans la figure 2, les courbes cinétiques d’absorption et de métabolisme des pesticides testés, à partir desquelles nous pouvons constater que les concentrations de pesticides dans les milieux de culture ont diminué de façon…

Discussion

Ce protocole a été développé pour évaluer la cytotoxicité intégrale des métabolites des pesticides triazolés dans les plantes en combinant des cals végétaux et des modèles de cellules humaines. Les étapes critiques de ce protocole proposé sont la culture de cal végétal et de cellules Caco-2. La partie la plus difficile et les conseils relatifs à la culture des callosités végétales ont été fournis dans notre étude précédente12. Ici, il conv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (21976160) et le projet de recherche sur l’application de la technologie du bien-être public de la province du Zhejiang (LGF21B070006).

     

Materials

2,4-dichlorophenoxyacetic acid WAKO 1 mg/L
20% H2O2 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10011218-500ML
6-benzylaminopurine WAKO 0.5 mg/L
75% ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 1269101-500 mL
96-well plate Thermo Fisher
Acetonitrile Sigma-Aldrich
Artificial climate incubator Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd RDN-1000A-4
Autoclaves STIK MJ-Series
Caco-2 cells Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
CCK8 reagents Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China G021-1-3
Centrifuge Thermo Fisher
CO2 incubator Labtrip HWJ-3-160
Dimethyl sulfoxide Solarbio Life Sciences D8371
Diniconazole, 98.7% J&K Scientific 83657-24-3
Dulbecco's modified Eagle's medium Solarbio Life Sciences 11965-500 mL
electronic balance Shanghai Precision Instrument Co., Ltd FA1004B
Fetal bovine serum Cellmax
Fluorescence spectrophotometer Tecan Infinite M200
Flusilazole, 98.5% J&K Scientific 85509-19-9  
Freeze dryer SCIENTZ
High-throughput tissue grinder SCIENTZ
Inverted microscope Leica Biosystems DMi1
Milli-Q system Millipore MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium HOPEBIO HB8469-7
Nitrogen blowing concentrator AOSHENG MD200-2
PBS Solarbio Life Sciences P1022-500 mL
Penicillin-Streptomycin Liquid Solarbio Life Sciences P1400-100 mL
Propiconazole, 100% J&K Scientific 60207-90-1 
Research plus Eppendorf 10-1000 μL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. THZ-98AB
Tebuconazole, 100% J&K Scientific 107534-96-3
Trypsin-EDTA solution Solarbio Life Sciences T1300-100 mL
Ultrasound machine ZKI UC-6
UV-sterilized super clean bench AIRTECH
Vortex instrument Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd BV-1010

References

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Cite This Article
Zhou, Q., Wang, Q., Wu, J., Zhang, A., Sun, J. Assessing Cytotoxicity of Metabolites of Typical Triazole Pesticides in Plants. J. Vis. Exp. (202), e66048, doi:10.3791/66048 (2023).

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