Beoordeling van cytotoxiciteit van metabolieten van typische triazolpesticiden in planten
Summary
Het protocol beschrijft een nieuwe methode om de integrale cytotoxiciteit van metabolieten van triazolpesticiden in planten te beoordelen.
Abstract
Verschillende organische verontreinigende stoffen zijn in het milieu terechtgekomen als gevolg van antropogene activiteiten. Deze verontreinigende stoffen kunnen worden opgenomen door gewassen, waardoor het ecosysteem en de menselijke gezondheid in de hele voedselketen een bedreiging kunnen vormen. De biotransformatie van verontreinigende stoffen in planten genereert een aantal metabolieten die toxischer kunnen zijn dan hun oorspronkelijke verbindingen, wat impliceert dat de metabolieten in aanmerking moeten worden genomen bij de toxiciteitsbeoordeling. De metabolieten van verontreinigende stoffen in planten zijn echter uiterst complex, waardoor het moeilijk is om de toxicologische informatie van alle metabolieten volledig te verkrijgen. Deze studie stelde een strategie voor om de integrale cytotoxiciteit van verontreinigende metabolieten in planten te beoordelen door ze tijdens toxicologische tests als geheel te behandelen. Triazol-pesticiden, een klasse van breedspectrumfungiciden, zijn op grote schaal toegepast in de landbouwproductie. Hun residuvervuiling in landbouwgrond heeft steeds meer aandacht getrokken. Daarom werden vier triazolpesticiden, waaronder flusilazol, diniconazol, tebuconazol en propiconazol, geselecteerd als de geteste verontreinigende stoffen. De metabolieten werden gegenereerd door de behandeling van wortelcallus met geteste triazolpesticiden. Na een behandeling van 72 uur werden de metabolieten van pesticiden in wortelcallus geëxtraheerd, gevolgd door toxicologische tests met behulp van de Caco-2-cellijn. De resultaten toonden aan dat de metabolieten van geteste pesticiden in wortelcallus de levensvatbaarheid van Caco-2-cellen (P>0,05) niet significant remden, wat geen cytotoxiciteit van metabolieten van pesticiden aantoonde. Deze voorgestelde methode opent een nieuwe weg om de cytotoxiciteit van verontreinigende metabolieten in planten te beoordelen, wat naar verwachting waardevolle gegevens zal opleveren voor een nauwkeurige beoordeling van de toxiciteit.
Introduction
Gewassen die op landbouwgrond groeien, kunnen worden blootgesteld aan verschillende organische verontreinigende stoffen die afkomstig zijn van antropogene activiteiten 1,2. De verontreinigende stoffen kunnen door planten worden opgenomen, waardoor het ecosysteem en de menselijke gezondheid via voedselketens verder worden bedreigd 3,4. De xenobiotica in planten ondergaan waarschijnlijk een reeks biotransformaties, zoals fase I- en II-metabolismen5, waarbij een aantal metabolieten worden gegenereerd. Volgens het concept van groene lever in planten kan het metabolisme van planten de toxiciteit van xenobiotica verminderen 6,7. Er is echter aangetoond dat de toxiciteit van sommige metabolieten hoger kan zijn dan die van hun ouders. Zo is bijvoorbeeld bewezen dat het gedebromeerde product van tetrabroombisfenol A (TBBPA) en het O-gemethyleerde product van bisfenol A (BPA) veel giftiger zijn dan hun ouders 8,9, en de debrominatie en O-methylering vormen de belangrijkste fase I-metabolismeroutes in planten. De toxiciteitsbeoordeling die uitsluitend is gebaseerd op de ouders van verontreinigende stoffen in planten is dus niet nauwkeurig, terwijl rekening moet worden gehouden met de overeenkomstige metabolieten.
De metabolieten van xenobiotica in planten zijn uiterst complex 10,11, waardoor het moeilijk is om ze volledig te identificeren en te scheiden. Bovendien kunnen slechts enkele standaarden van geïdentificeerde metabolieten worden verkregen. Daarom zijn er geen toxicologische gegevens van alle metabolieten beschikbaar, wat een uitgebreide toxiciteitsbeoordeling bemoeilijkt. Deze studie stelde een strategie voor om de integrale toxiciteit van verontreinigende metabolieten in planten te beoordelen door ze als geheel te behandelen tijdens toxicologische tests, waardoor nieuwe gegevens werden verkregen voor een nauwkeurige toxiciteitsbeoordeling van verontreinigende stoffen in planten. Onze eerdere studie heeft aangetoond dat de eeltcultuur van planten een eenvoudige en effectieve weg opent om metabolieten van xenobiotica in planten te verkrijgen12. Dienovereenkomstig werd de plantaardige calluscultuur in deze studie gebruikt om de metabolieten van verontreinigende stoffen in planten te genereren, gevolgd door chemische extractie en toxicologische tests met behulp van een menselijke cellijn. Het darmkanaal is een van de directe doelorganen van xenobiotica die worden blootgesteld aan dieren en mensen. De Caco-2-cellijn heeft bewezen het beste model te zijn voor het onderzoeken van het darmgedrag en de toxiciteit van xenobiotica in vitro 13,14,15. Daarom werd in deze studie het Caco-2-celmodel geselecteerd.
Triazol-pesticiden, een klasse van breedspectrumfungiciden, zijn op grote schaal toegepast in de landbouwproductie16. Hun residuvervuiling in landbouwgrond heeft steeds meer aandacht getrokken 17,18. Hier werden vier veelgebruikte triazolpesticiden, waaronder flusilazol, diniconazol, tebuconazol en propiconazol, geselecteerd als de typische verontreinigende stoffen. Wortel werd in dit onderzoek geselecteerd als representatieve plant voor verse, kant-en-klare groenten. Worteleelt werd aanvankelijk blootgesteld aan de geteste pesticiden in een concentratie van 100 mg/L. Na een blootstelling van 72 uur werden de metabolieten geëxtraheerd om de cytotoxiciteit te beoordelen met behulp van Caco-2-cellijn. Deze methode kan gemakkelijk worden uitgebreid om de integrale cytotoxiciteit van metabolieten van andere soorten verontreinigende stoffen in planten te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is ontwikkeld om de integrale cytotoxiciteit van metabolieten van triazolpesticiden in planten te beoordelen door planteelt en menselijke celmodellen te combineren. De cruciale stappen voor dit voorgestelde protocol zijn de kweek van planteelt en Caco-2-cel. Het moeilijkste deel en het meest relatieve advies voor de eeltcultuur van planten zijn gegeven in onze vorige studie12. Hier moet worden opgemerkt dat celonderhoud het moeilijkste onderdeel is vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (21976160) en het Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006) van de provincie Zhejiang.
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500 mL | |
| 96-well plate | Thermo Fisher | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| Caco-2 cells | Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd. | ||
| CCK8 reagents | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China | G021-1-3 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| CO2 incubator | Labtrip | HWJ-3-160 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio Life Sciences | D8371 | |
| Diniconazole, 98.7% | J&K Scientific | 83657-24-3 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Solarbio Life Sciences | 11965-500 mL | |
| electronic balance | Shanghai Precision Instrument Co., Ltd | FA1004B | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Tecan | Infinite M200 | |
| Flusilazole, 98.5% | J&K Scientific | 85509-19-9 | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Inverted microscope | Leica Biosystems | DMi1 | |
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| Nitrogen blowing concentrator | AOSHENG | MD200-2 | |
| PBS | Solarbio Life Sciences | P1022-500 mL | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio Life Sciences | P1400-100 mL | |
| Propiconazole, 100% | J&K Scientific | 60207-90-1 | |
| Research plus | Eppendorf | 10-1000 μL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | THZ-98AB | |
| Tebuconazole, 100% | J&K Scientific | 107534-96-3 | |
| Trypsin-EDTA solution | Solarbio Life Sciences | T1300-100 mL | |
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized super clean bench | AIRTECH | ||
| Vortex instrument | Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd | BV-1010 |
References
- Fan, Y., et al. Uptake of halogenated organic compounds (HOCs) into peanut and corn during the whole life cycle grown in an agricultural field. Environ Pollut. 263, 114400 (2020).
- Wu, Q., et al. Trace metals in e-waste lead to serious health risk through consumption of rice growing near an abandoned e-waste recycling site: Comparisons with PBDEs and AHFRs. Environ Pollut. 247, 46-54 (2019).
- Liu, A. F., et al. Tetrabromobisphenol-A/S and nine novel analogs in biological samples from the Chinese Bohai Sea: Implications for trophic transfer. Environ Sci Technol. 50 (8), 4203-4211 (2016).
- Awasthi, A. K., Zeng, X., Li, J. Environmental pollution of electronic waste recycling in India: A critical review. Environ Pollut. 211, 259-270 (2016).
- Zhang, Q., et al. Plant accumulation and transformation of brominated and organophosphate flame retardants: A review. Environ Pollut. 288, 117742 (2021).
- Sandermann, H. Higher plant metabolism of xenobiotics: the ‘green liver’ concept. Pharmacogenetics. 4, 225-241 (1994).
- Zhang, J. J., Yang, H. Metabolism and detoxification of pesticides in plants. Sci Total Environ. 790, 148034 (2021).
- Debenest, T., et al. Ecotoxicity of a brominated flame retardant (tetrabromobisphenol A) and its derivatives to aquatic organisms. Comp Biochem Phys C. 152 (4), 407-412 (2010).
- McCormick, J. M., Van Es, T., Cooper, K. R., White, L. A., Haggblom, M. M. Microbially mediated O-methylation of bisphenol A results in metabolites with increased toxicity to the developing zebrafish (Danio rerio) embryo. Environ Sci Technol. 45 (15), 6567-6574 (2011).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environ Sci Technol. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environ Sci Technol. 53 (15), 8805-8812 (2019).
- Wu, J., et al. Elucidating the metabolism of 2,4-Dibromophenol in plants. J Vis Exp. (192), e65089 (2023).
- Zucco, F., et al. An Inter-laboratory study to evaluate the effects of medium composition on the differentiation and barrier function of Caco-2 cell lines. Atla-Altern Lab Anim. 33, 603-618 (2005).
- Eisenbrand, G., et al. Methods of in vitro toxicology. Food Chem Toxicol. 40, 193-236 (2002).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21, 1-26 (2005).
- Li, H., et al. Uptake, translocation, and subcellular distribution of three triazole pesticides in rice. Environ Sci Pollut Res. 29 (17), 25581-25590 (2022).
- Satapute, P., Kamble, M. V., Adhikari, S. S., Jogaiah, S. Influence of triazole pesticides on tillage soil microbial populations and metabolic changes. Sci Total Environ. 651, 2334-2344 (2019).
- Xu, Y., et al. A possible but unrecognized risk of acceptable daily intake dose triazole pesticides exposure-bile acid disturbance induced pharmacokinetic changes of oral medication. Chemosphere. 322, 138209 (2023).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
