Bitkilerde Tipik Triazol Pestisitlerin Metabolitlerinin Sitotoksisitesinin Değerlendirilmesi
Summary
Protokol, bitkilerde triazol pestisitlerinin metabolitlerinin integral sitotoksisitesini değerlendirmek için yeni bir yöntemi açıklamaktadır.
Abstract
Antropojenik faaliyetler nedeniyle çevreye çeşitli organik kirleticiler salınmıştır. Bu kirleticiler, mahsul bitkileri tarafından alınabilir ve besin zinciri boyunca ekosistem ve insan sağlığı için potansiyel tehditlere neden olabilir. Bitkilerdeki kirleticilerin biyotransformasyonu, ana bileşiklerinden daha toksik olabilen bir dizi metabolit üretir, bu da toksisite değerlendirmesi sırasında metabolitlerin dikkate alınması gerektiğini ima eder. Bununla birlikte, bitkilerdeki kirleticilerin metabolitleri son derece karmaşıktır ve tüm metabolitlerin toksikolojik bilgilerinin kapsamlı bir şekilde elde edilmesini zorlaştırır. Bu çalışma, bitkilerdeki kirletici metabolitlerin bütünsel sitotoksisitesini, toksikolojik testler sırasında bir bütün olarak ele alarak değerlendirmek için bir strateji önermiştir. Geniş spektrumlu fungisitlerin bir sınıfı olan triazol pestisitler, tarımsal üretimde yaygın olarak uygulanmaktadır. Tarım arazilerindeki kalıntı kirliliği giderek daha fazla dikkat çekmiştir. Bu nedenle, test edilen kirleticiler olarak flusilazol, dinikonazol, tebukonazol ve propikonazol dahil olmak üzere dört triazol pestisit seçildi. Metabolitler, havuç kallusunun test edilmiş triazol pestisitlerle muamele edilmesiyle üretildi. 72 saatlik muameleden sonra, havuç kallustaki pestisitlerin metabolitleri ekstrakte edildi, ardından Caco-2 hücre hattı kullanılarak toksikolojik testler yapıldı. Sonuçlar, havuç kallusunda test edilen pestisitlerin metabolitlerinin, Caco-2 hücrelerinin (P>0.05) canlılığını önemli ölçüde inhibe etmediğini ve pestisit metabolitlerinin sitotoksisitesini göstermediğini gösterdi. Önerilen bu yöntem, bitkilerdeki kirletici metabolitlerin sitotoksisitesini değerlendirmek için yeni bir yol açmaktadır ve bu da kesin toksisite değerlendirmesi için değerli veriler sağlaması beklenmektedir.
Introduction
Tarım arazilerinde yetişen mahsul bitkileri, antropojenik faaliyetlerden kaynaklanan çeşitli organik kirleticilere maruz kalabilir 1,2. Kirleticiler bitkiler tarafından alınabilir ve besin zincirleri yoluyla ekosistem ve insan sağlığı için daha fazla tehdide neden olabilir 3,4. Bitkilerdeki ksenobiyotikler muhtemelen Faz I ve II metabolizmaları5 gibi bir dizi biyotransformasyona uğrar ve bir dizi metabolit üretir. Bitkilerde yeşil karaciğer kavramına göre, bitki metabolizması ksenobiyotiklerintoksisitesini azaltabilir 6,7. Bununla birlikte, bazı metabolitlerin toksisitesinin ebeveynlerinden daha yüksek olabileceği ortaya çıkmıştır. Örneğin, tetrabromobisfenol A’nın (TBBPA) debromlu ürününün ve bisfenol A’nın (BPA) O-metillenmiş ürünününebeveynlerinden çok daha toksik olduğu kanıtlanmıştır 8,9 ve debrominasyon ve O-metilasyon, bitkilerde ana Faz I metabolizma yollarını içerir. Bu nedenle, yalnızca bitkilerdeki kirletici ebeveynlere dayanan toksisite değerlendirmesi doğru değildir, ancak karşılık gelen metabolitler dikkate alınmalıdır.
Bitkilerdeki ksenobiyotiklerin metabolitleri son derece karmaşıktır10,11, bu da onları kapsamlı bir şekilde tanımlamayı ve ayırmayı zorlaştırır. Ek olarak, tanımlanmış metabolitlerin sadece birkaç standardı elde edilebilir. Bu nedenle, tüm metabolitlerin toksikolojik verileri mevcut değildir, bu da kapsamlı bir toksisite değerlendirmesini engeller. Bu çalışma, bitkilerdeki kirletici metabolitlerinin bütünsel toksisitesini, toksikolojik testler sırasında bir bütün olarak ele alarak değerlendirmek için bir strateji önerdi ve bitkilerdeki kirleticilerin kesin toksisite değerlendirmesi için yeni veriler sağladı. Önceki çalışmamız, bitki kallus kültürünün bitkilerde ksenobiyotiklerin metabolitlerini elde etmek için basit ve etkili bir yol açtığını ortaya koymuştur12. Buna göre, bu çalışmada bitkilerdeki kirleticilerin metabolitlerini oluşturmak için bitki kallus kültürü kullanılmış, ardından bir insan hücre hattı kullanılarak kimyasal ekstraksiyon ve toksikolojik testler yapılmıştır. Bağırsak sistemi, hayvanlara ve insanlara maruz kalan ksenobiyotiklerin doğrudan hedef organlarından biridir. Caco-2 hücre hattının, in vitro 13,14,15 ksenobiyotiklerin bağırsak davranışlarını ve toksisitesini araştırmak için en iyi model olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, bu çalışmada Caco-2 hücre modeli seçilmiştir.
Geniş spektrumlu fungisitlerin bir sınıfı olan triazol pestisitler, tarımsal üretimde yaygın olarak uygulanmaktadır16. Tarım arazilerindeki kalıntı kirliliği giderek daha fazla dikkat çekmektedir 17,18. Burada, flusilazol, dinikonazol, tebukonazol ve propikonazol dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan dört triazol pestisit, tipik kirleticiler olarak seçilmiştir. Bu çalışmada taze, yemeye hazır sebzeler için temsili bitki olarak havuç seçilmiştir. Havuç kallus başlangıçta 100 mg / L’lik bir konsantrasyonda test edilen pestisitlere maruz bırakıldı. 72 saat maruz kaldıktan sonra, Caco-2 hücre hattı kullanılarak sitotoksisiteyi değerlendirmek için metabolitler ekstrakte edildi. Bu yöntem, bitkilerdeki diğer kirletici türlerinin metabolitlerinin integral sitotoksisitesini değerlendirmek için kolayca genişletilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, bitki kallusları ve insan hücre modellerini birleştirerek bitkilerde triazol pestisitlerinin metabolitlerinin integral sitotoksisitesini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Önerilen bu protokol için kritik adımlar, bitki kallus kültürü ve Caco-2 hücresidir. Bitki kallus kültürü için en zor kısım ve göreceli tavsiyeler önceki çalışmamızda verilmiştir12. Burada, hücre bakımının Caco-2 hücre kültürü için en zor kıs?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (21976160) ve Zhejiang Eyaleti Kamu Refahı Teknolojisi Uygulama Araştırma Projesi (LGF21B070006) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500 mL | |
| 96-well plate | Thermo Fisher | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| Caco-2 cells | Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd. | ||
| CCK8 reagents | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China | G021-1-3 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| CO2 incubator | Labtrip | HWJ-3-160 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio Life Sciences | D8371 | |
| Diniconazole, 98.7% | J&K Scientific | 83657-24-3 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Solarbio Life Sciences | 11965-500 mL | |
| electronic balance | Shanghai Precision Instrument Co., Ltd | FA1004B | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Tecan | Infinite M200 | |
| Flusilazole, 98.5% | J&K Scientific | 85509-19-9 | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Inverted microscope | Leica Biosystems | DMi1 | |
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| Nitrogen blowing concentrator | AOSHENG | MD200-2 | |
| PBS | Solarbio Life Sciences | P1022-500 mL | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio Life Sciences | P1400-100 mL | |
| Propiconazole, 100% | J&K Scientific | 60207-90-1 | |
| Research plus | Eppendorf | 10-1000 μL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | THZ-98AB | |
| Tebuconazole, 100% | J&K Scientific | 107534-96-3 | |
| Trypsin-EDTA solution | Solarbio Life Sciences | T1300-100 mL | |
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized super clean bench | AIRTECH | ||
| Vortex instrument | Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd | BV-1010 |
References
- Fan, Y., et al. Uptake of halogenated organic compounds (HOCs) into peanut and corn during the whole life cycle grown in an agricultural field. Environ Pollut. 263, 114400 (2020).
- Wu, Q., et al. Trace metals in e-waste lead to serious health risk through consumption of rice growing near an abandoned e-waste recycling site: Comparisons with PBDEs and AHFRs. Environ Pollut. 247, 46-54 (2019).
- Liu, A. F., et al. Tetrabromobisphenol-A/S and nine novel analogs in biological samples from the Chinese Bohai Sea: Implications for trophic transfer. Environ Sci Technol. 50 (8), 4203-4211 (2016).
- Awasthi, A. K., Zeng, X., Li, J. Environmental pollution of electronic waste recycling in India: A critical review. Environ Pollut. 211, 259-270 (2016).
- Zhang, Q., et al. Plant accumulation and transformation of brominated and organophosphate flame retardants: A review. Environ Pollut. 288, 117742 (2021).
- Sandermann, H. Higher plant metabolism of xenobiotics: the ‘green liver’ concept. Pharmacogenetics. 4, 225-241 (1994).
- Zhang, J. J., Yang, H. Metabolism and detoxification of pesticides in plants. Sci Total Environ. 790, 148034 (2021).
- Debenest, T., et al. Ecotoxicity of a brominated flame retardant (tetrabromobisphenol A) and its derivatives to aquatic organisms. Comp Biochem Phys C. 152 (4), 407-412 (2010).
- McCormick, J. M., Van Es, T., Cooper, K. R., White, L. A., Haggblom, M. M. Microbially mediated O-methylation of bisphenol A results in metabolites with increased toxicity to the developing zebrafish (Danio rerio) embryo. Environ Sci Technol. 45 (15), 6567-6574 (2011).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environ Sci Technol. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environ Sci Technol. 53 (15), 8805-8812 (2019).
- Wu, J., et al. Elucidating the metabolism of 2,4-Dibromophenol in plants. J Vis Exp. (192), e65089 (2023).
- Zucco, F., et al. An Inter-laboratory study to evaluate the effects of medium composition on the differentiation and barrier function of Caco-2 cell lines. Atla-Altern Lab Anim. 33, 603-618 (2005).
- Eisenbrand, G., et al. Methods of in vitro toxicology. Food Chem Toxicol. 40, 193-236 (2002).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21, 1-26 (2005).
- Li, H., et al. Uptake, translocation, and subcellular distribution of three triazole pesticides in rice. Environ Sci Pollut Res. 29 (17), 25581-25590 (2022).
- Satapute, P., Kamble, M. V., Adhikari, S. S., Jogaiah, S. Influence of triazole pesticides on tillage soil microbial populations and metabolic changes. Sci Total Environ. 651, 2334-2344 (2019).
- Xu, Y., et al. A possible but unrecognized risk of acceptable daily intake dose triazole pesticides exposure-bile acid disturbance induced pharmacokinetic changes of oral medication. Chemosphere. 322, 138209 (2023).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
