Valutazione della citotossicità dei metaboliti dei tipici pesticidi triazolici nelle piante
Summary
Il protocollo descrive un nuovo metodo per valutare la citotossicità integrale dei metaboliti dei pesticidi triazolici nelle piante.
Abstract
Diversi inquinanti organici sono stati rilasciati nell’ambiente a causa delle attività antropiche. Questi inquinanti possono essere assorbiti dalle piante coltivate, causando potenziali minacce all’ecosistema e alla salute umana lungo tutta la catena alimentare. La biotrasformazione degli inquinanti nelle piante genera una serie di metaboliti che possono essere più tossici dei loro composti originari, il che implica che i metaboliti dovrebbero essere presi in considerazione durante la valutazione della tossicità. Tuttavia, i metaboliti degli inquinanti nelle piante sono estremamente complessi, il che rende difficile ottenere in modo completo le informazioni tossicologiche di tutti i metaboliti. Questo studio ha proposto una strategia per valutare la citotossicità integrale dei metaboliti inquinanti nelle piante trattandoli nel loro insieme durante i test tossicologici. I pesticidi triazolici, una classe di fungicidi ad ampio spettro, sono stati ampiamente applicati nella produzione agricola. L’inquinamento da residui nei terreni agricoli ha attirato sempre più attenzione. Pertanto, quattro pesticidi triazolici, tra cui flusilazolo, diniconazolo, tebuconazolo e propiconazolo, sono stati selezionati come inquinanti testati. I metaboliti sono stati generati dal trattamento del callo di carota con pesticidi triazolici testati. Dopo un trattamento di 72 ore, sono stati estratti i metaboliti dei pesticidi nel callo di carota, seguiti da test tossicologici utilizzando la linea cellulare Caco-2. I risultati hanno mostrato che i metaboliti dei pesticidi testati nel callo di carota non hanno inibito significativamente la vitalità delle cellule Caco-2 (P>0,05), dimostrando l’assenza di citotossicità dei metaboliti dei pesticidi. Questo metodo proposto apre una nuova strada per valutare la citotossicità dei metaboliti inquinanti nelle piante, che dovrebbe fornire dati preziosi per una valutazione precisa della tossicità.
Introduction
Le piante coltivate che crescono nei terreni agricoli possono essere esposte a vari inquinanti organici provenienti da attività antropiche 1,2. Gli inquinanti possono essere assorbiti dalle piante, causando ulteriori minacce all’ecosistema e alla salute umana attraverso le catene alimentari 3,4. Gli xenobiotici nelle piante probabilmente subiscono una serie di biotrasformazioni, come i metabolismi di fase I e II5, generando una serie di metaboliti. Secondo il concetto di fegato verde nelle piante, il metabolismo delle piante può ridurre la tossicità degli xenobiotici 6,7. Tuttavia, è stato rivelato che la tossicità di alcuni metaboliti potrebbe essere superiore a quella dei loro genitori. Ad esempio, è stato dimostrato che il prodotto debromurato del tetrabromobisfenolo A (TBBPA) e il prodotto O-metilato del bisfenolo A (BPA) sono molto più tossici dei loro genitori 8,9 e la debromurazione e l’O-metilazione comprendono le principali vie metaboliche di Fase I nelle piante. Pertanto, la valutazione della tossicità basata esclusivamente sui genitori inquinanti nelle piante non è accurata, mentre dovrebbero essere presi in considerazione i metaboliti corrispondenti.
I metaboliti degli xenobiotici nelle piante sono estremamente complessi 10,11, il che rende difficile identificarli e separarli in modo completo. Inoltre, è possibile ottenere solo pochi standard di metaboliti identificati. Pertanto, non sono disponibili dati tossicologici su tutti i metaboliti, il che ostacola una valutazione completa della tossicità. Questo studio ha proposto una strategia per valutare la tossicità integrale dei metaboliti inquinanti nelle piante trattandoli nel loro insieme durante i test tossicologici, fornendo nuovi dati per una valutazione precisa della tossicità degli inquinanti nelle piante. Il nostro studio precedente ha rivelato che la coltura del callo vegetale apre una strada semplice ed efficace per ottenere metaboliti di xenobiotici nelle piante12. Di conseguenza, la coltura del callo vegetale è stata impiegata in questo studio per generare i metaboliti degli inquinanti nelle piante, seguita da estrazione chimica e test tossicologici utilizzando una linea cellulare umana. Il tratto intestinale è uno degli organi bersaglio diretti degli xenobiotici esposti agli animali e all’uomo. La linea cellulare Caco-2 ha dimostrato di essere il miglior modello per studiare i comportamenti intestinali e la tossicità degli xenobiotici in vitro 13,14,15. Pertanto, in questo studio è stato selezionato il modello di cellule Caco-2.
I pesticidi triazolici, una classe di fungicidi ad ampio spettro, sono stati ampiamente applicati nella produzione agricola16. L’inquinamento da residui nei terreni agricoli ha attirato un’attenzione crescente17,18. Qui, quattro pesticidi triazolici comunemente usati, tra cui flusilazolo, diniconazolo, tebuconazolo e propiconazolo, sono stati selezionati come inquinanti tipici. La carota è stata selezionata in questo studio come pianta rappresentativa per le verdure fresche e pronte da mangiare. Il callo di carota è stato inizialmente esposto ai pesticidi testati a una concentrazione di 100 mg/L. Dopo un’esposizione di 72 ore, i metaboliti sono stati estratti per valutare la citotossicità utilizzando la linea cellulare Caco-2. Questo metodo può essere facilmente esteso per valutare la citotossicità integrale dei metaboliti di altri tipi di inquinanti nelle piante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è stato sviluppato per valutare la citotossicità integrale dei metaboliti dei pesticidi triazolici nelle piante combinando modelli di callo vegetale e cellule umane. I passaggi critici per questo protocollo proposto sono la coltura del callo vegetale e della cellula Caco-2. La parte più difficile e i relativi consigli per la coltura del callo delle piante sono stati forniti nel nostro precedente studio12. Qui, va notato che il mantenimento del…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (21976160) e dal Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006) della provincia di Zhejiang.
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500 mL | |
| 96-well plate | Thermo Fisher | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| Caco-2 cells | Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd. | ||
| CCK8 reagents | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China | G021-1-3 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| CO2 incubator | Labtrip | HWJ-3-160 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio Life Sciences | D8371 | |
| Diniconazole, 98.7% | J&K Scientific | 83657-24-3 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Solarbio Life Sciences | 11965-500 mL | |
| electronic balance | Shanghai Precision Instrument Co., Ltd | FA1004B | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Tecan | Infinite M200 | |
| Flusilazole, 98.5% | J&K Scientific | 85509-19-9 | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Inverted microscope | Leica Biosystems | DMi1 | |
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| Nitrogen blowing concentrator | AOSHENG | MD200-2 | |
| PBS | Solarbio Life Sciences | P1022-500 mL | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio Life Sciences | P1400-100 mL | |
| Propiconazole, 100% | J&K Scientific | 60207-90-1 | |
| Research plus | Eppendorf | 10-1000 μL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | THZ-98AB | |
| Tebuconazole, 100% | J&K Scientific | 107534-96-3 | |
| Trypsin-EDTA solution | Solarbio Life Sciences | T1300-100 mL | |
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized super clean bench | AIRTECH | ||
| Vortex instrument | Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd | BV-1010 |
References
- Fan, Y., et al. Uptake of halogenated organic compounds (HOCs) into peanut and corn during the whole life cycle grown in an agricultural field. Environ Pollut. 263, 114400 (2020).
- Wu, Q., et al. Trace metals in e-waste lead to serious health risk through consumption of rice growing near an abandoned e-waste recycling site: Comparisons with PBDEs and AHFRs. Environ Pollut. 247, 46-54 (2019).
- Liu, A. F., et al. Tetrabromobisphenol-A/S and nine novel analogs in biological samples from the Chinese Bohai Sea: Implications for trophic transfer. Environ Sci Technol. 50 (8), 4203-4211 (2016).
- Awasthi, A. K., Zeng, X., Li, J. Environmental pollution of electronic waste recycling in India: A critical review. Environ Pollut. 211, 259-270 (2016).
- Zhang, Q., et al. Plant accumulation and transformation of brominated and organophosphate flame retardants: A review. Environ Pollut. 288, 117742 (2021).
- Sandermann, H. Higher plant metabolism of xenobiotics: the ‘green liver’ concept. Pharmacogenetics. 4, 225-241 (1994).
- Zhang, J. J., Yang, H. Metabolism and detoxification of pesticides in plants. Sci Total Environ. 790, 148034 (2021).
- Debenest, T., et al. Ecotoxicity of a brominated flame retardant (tetrabromobisphenol A) and its derivatives to aquatic organisms. Comp Biochem Phys C. 152 (4), 407-412 (2010).
- McCormick, J. M., Van Es, T., Cooper, K. R., White, L. A., Haggblom, M. M. Microbially mediated O-methylation of bisphenol A results in metabolites with increased toxicity to the developing zebrafish (Danio rerio) embryo. Environ Sci Technol. 45 (15), 6567-6574 (2011).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environ Sci Technol. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environ Sci Technol. 53 (15), 8805-8812 (2019).
- Wu, J., et al. Elucidating the metabolism of 2,4-Dibromophenol in plants. J Vis Exp. (192), e65089 (2023).
- Zucco, F., et al. An Inter-laboratory study to evaluate the effects of medium composition on the differentiation and barrier function of Caco-2 cell lines. Atla-Altern Lab Anim. 33, 603-618 (2005).
- Eisenbrand, G., et al. Methods of in vitro toxicology. Food Chem Toxicol. 40, 193-236 (2002).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21, 1-26 (2005).
- Li, H., et al. Uptake, translocation, and subcellular distribution of three triazole pesticides in rice. Environ Sci Pollut Res. 29 (17), 25581-25590 (2022).
- Satapute, P., Kamble, M. V., Adhikari, S. S., Jogaiah, S. Influence of triazole pesticides on tillage soil microbial populations and metabolic changes. Sci Total Environ. 651, 2334-2344 (2019).
- Xu, Y., et al. A possible but unrecognized risk of acceptable daily intake dose triazole pesticides exposure-bile acid disturbance induced pharmacokinetic changes of oral medication. Chemosphere. 322, 138209 (2023).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
