Ex Vivo (Canlı Canlı) Plasental Eksplant Akış Kültürü - Utero'daki Dinamik Koşulları Taklit Etmek

Bu yayının bazı bölümleri ve sonuçları zaten yayınlanmıştır (Bkz. referans 3 ve 23). Deney düzeneğiŞekil 1’de bir deney düzeneği gösterilmektedir. Kompozit bir akış döngüsü, seri olarak birbirine bağlanmış beş akış odasından oluşur (Şekil 1A). Her akış odasında, her biri yaklaşık 0,5 cm kesit çapına sahip dört eksplant yetiştirilir (Şekil 1 A,C). Statik kontrol deneyi için, eksplantlar altı oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarında yetiştirilir (Şekil 1B). Eksplantların dışarı atılmasını önlemek için, dar iğne şeklindeki çıkıntılara sahip metal plakalara yapıştırılırlar (Şekil 1 D,E). Eksplantları ortamın doğrudan akışına maruz bırakmak için, girişler ve çıkışlar baş bölümünde konumlandırılmış olarak bölmeler ters çevrilir (Şekil 1 F,G). Biyoreaktör içinde, akış döngüsü peristaltik bir pompaya bağlıdır. Akış kültürlü doku ile geleneksel olarak statik kültürlenmiş doku arasındaki doku bütünlüğünü karşılaştırmak amacıyla, eksplantlar akış döngüsüne bitişik altı oyuklu bir plakaya yerleştirilir. Bu, oksijen, sıcaklık ve nem açısından tutarlı kültür koşullarının doğrulanmasını sağlar (Şekil 1A)3. Morfolojik analiz β-aktinÇeşitli yetiştirme koşullarıyla ilişkili doku bütünlüğündeki histolojik ayrımları incelemek için çeşitli immünohistokimyasal boyama prosedürleri uygulanmıştır (Şekil 2). Diseksiyon sonrası derhal gömülen eksplantlar, temel referans olarak görev yaptı. Villöz eksplantlar içindeki aktin hücre iskeletinin analizi için β-aktin boyaması yapıldı (Şekil 2A-E). Tanımlayıcı analiz, hücre iskeletinin yeni elde edilmiş dokuda iyi yapılandırılmış ve organize edilmiş bir görsel sunumunu ortaya çıkardı (Şekil 2A). Zamanla, yetiştirme ilerledikçe, hücre iskeleti yapısında bir bozulma olduğunu gösteren gözlemlenebilir bir mikrofilament birikimi oldu. Bu fenomen, statik yetiştirme3 geçiren villöz eksplantlarda tutarlı bir şekilde gözlenmiştir (Şekil 2C, E, yıldızlarla gösterilmiştir). H & E boyamaH&E boyama, doku bütünlüğünün statik kültür boyunca azaldığı gözlemine ek takviye sağlamıştır, bu eğilim akış kültürü bağlamında iyileştirilmiştir (Şekil 2F-J). Taze doku, yoğun ve sıkı bir şekilde paketlenmiş bir stroma ile karakterize edilen villöz eksplantların yapılandırılmış ve karakteristik bir histolojik sunumunu sergiledi (Şekil 2F). Ek olarak, sinsityotrofoblast alttaki stromaya sıkıca yapışmıştır (Şekil 2F). 24 saat boyunca bir akış ortamında kültürlenen villöz eksplantlarda karşılaştırılabilir bir görünüm kaydedilmiştir (Şekil 2G). Bununla birlikte, akış altında 48 saatlik ekimden sonra, sinsitiyotrofoblastın bölümlerinin kısmen ayrıldığı gözlendi (Şekil 2I, okla gösterilmiştir), stroma içinde sporadik küçük lakunalar eşlik eder. Dokunun histolojik incelemesi, statik kültür koşulunda 24 saat sonra doku bütünlüğünün yeterince korunmadığını gösterdi (Şekil 2H). Ayrıca, bu bütünlük statik kültürde 48 saat sonra belirgin bir şekilde bozulmuştur (Şekil 2J). Stroma gözenekli ve çukurlu bir görünüm sergiledi ve sinsityotrofoblastın stromadan önemli ölçüde ayrılması daha geniş bölgelerde belirgindi3. CD34IICD34II boyama, endotel hücrelerini ve sonuç olarak villöz eksplantlar içindeki feto-plasental kan damarlarını görselleştirmek için kullanıldı (Şekil 2K-O). Diseksiyondan hemen sonra doğrudan gömülen doku, endotel hücrelerinin belirgin bir şekilde organize edilmiş bir düzenini sergiledi (Şekil 2K). Feto-plasental kan damarlarının morfolojik bütünlüğü, akış kültüründen 24 saat sonra ve sıklıkla 48 saat sonra bile iyi korunmuştur, ancak akış koşulları altında ara sıra çökmüş kan damarları vakaları kaydedilmiştir (Şekil 2 L, N). Bununla birlikte, 24 saatlik statik kültürü takiben, kan damarları, bozulmuş görsel görünümlerinin kanıtladığı gibi kısmi çökme sergiledi (Şekil 2M, ok uçlarıyla gösterilmiştir). Statik kültür ortamındaki kan damarlarının bu bozulmasının, uzun ekim süresi ile daha da kötüleştiği görülmüştür. Özetle, hem akış hem de statik kültürden sonra villöz eksplantların tanımlayıcı morfolojik değerlendirmesi, statik kültür modu3 ile karşılaştırıldığında doku bütünlüğünün akış sistemi içinde daha etkili bir şekilde korunduğunu göstermiştir. Ekili dokunun ultrastrüktürel analizi Transmisyon elektron mikroskobuVillöz eksplantların morfolojisinin daha ayrıntılı bir incelemesini yapmak için, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak ek ultrastrüktürel analizler yapıldı (Şekil 3A-E). Bu bulgular histolojik araştırmaların sonuçlarını doğruladı. Preparasyondan hemen sonra doğrudan gömülen dokuda, morfoloji son derece iyi korunmuştur (Şekil 3A). Mikrovilluslar, sinsitiyotrofoblastın yüzeyinde açıkça fark edilebilirdi. Sinsitiyotrofoblast, bazal membran ile doğrudan temas kurarak, yanal hücre sınırları olmayan kendine özgü sürekli katmanını sundu. Taze dokunun stroması, önemli delikler veya yırtılmalar olmaksızın yoğun bir paketleme sergiledi. Ayrıca, kan damarlarının ultrastrüktürel görünümü ve bireyselleştirilmiş intravasküler eritrositler de mükemmel koruma göstermiştir (Şekil 3A). 24 saatlik akış kültüründen sonra bile, doku örneklerinin genel morfolojisi nispeten iyi korunmuştur (Şekil 3D). Sinsityotrofoblastın yüzeyinde taze dokuya kıyasla biraz daha az mikrovillus bulunurken, sinsityotrofoblast esas olarak bazal membrana bağlı kalmıştır. Sinsityotrofoblastın iç kısmında çekirdekler ve ara sıra küçük vakuoller gözlenebilirdi. Plasental villus içindeki stroma iyi korunmuş görünüyordu ve taze dokuya çok benziyordu (Şekil 3D). 48 saatlik akış kültürünü takiben bile, stromal hücreler, bazı delikler mevcut olsa da, nispeten iyi bir koruma sergilemiştir (Şekil 3E). Şaşırtıcı bir şekilde, doku içinde lipit damlacıkları tespit edildi. Sinsitiyotrofoblast vakuoller ve mikrovillus sayısında azalma gösterirken, birçok bölgede bazal membrana bağlı kaldı ve sinsityal ve hücre çekirdekleri açıkça görülebiliyordu (Şekil 3E). Akış kültüründen elde edilen dokunun tam tersine, statik kültüre maruz kalan villöz dokunun morfolojisi 24 saat gibi erken bir sürede bozulma gösterdi (Şekil 3B). Sinsitiyotrofoblast, birçok bölgede bazal membrandan ayrıldı ve nispeten önemli delikler gösterdi. Ek olarak, lipid damlacıkları hem sinsityotrofoblastta hem de stromada sıklıkla belirgindi. 48 saatlik statik kültürü takiben, üst yapıda ilerleyici bir düşüş belirgindi. Sinsitiyotrofoblast, bazal membrandan önemli ölçüde çok sayıda delik ve ayrılma gösterdi. Stroma içindeki hücrelerin yanı sıra kan damarlarını oluşturan endotel hücrelerini tanımlamak zorlaştı. Ayrıca, 48 saatlik statik kültürden sonra villöz eksplantlarda kayda değer bir lipit damlacıkları birikimi vardı (Şekil 3C). Özetle, statik kültürdeki dokunun üst yapısı, yetiştirme süresi boyunca art arda bozulma sergiledi, bu eğilim akış koşulları altında yetiştirme ile hafifletildi3. Taramalı elektron mikroskobuTaramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak, villöz eksplantların yüzeyinin ayrıntılı bir incelemesi kolaylaştırılmıştır (Şekil 4A-J). Yeni gömülmüş doku, yüzeyi boyunca yoğun nüfuslu bir mikrovillus dizisi sergiledi (Şekil 4 A, B). Bazı bölgelerde vezikül benzeri yapılar sergilenmiştir. Buna karşılık, statik kültürden alınan doku, 24 saat sonra mikrovilluslarda önemli bir azalma gösterdi (Şekil 4C, D), 48 saat sonra devam eden bir azalma (Şekil 4E, F). Bazı bölgeler serbest bırakılmamış vezikül benzeri yapıların toplanmasını gösterirken, diğer bölgeler çıplak ve aşınmış görünüyordu (Şekil 4D, F). Akış kültürüne maruz kalan dokuda, mikrovilluslar 24 saat sonra (Şekil 4G, H) ve 48 saat sonra (Şekil 4I, J) yüzeyde hala mevcuttu, ancak taze dokudan daha az ölçüde mevcuttu. Statik kültürle karşılaştırıldığında, yüzeydeki vezikül benzeri yapıların prevalansı azalmıştır. Şaşırtıcı bir şekilde, bu vezikül benzeri yapılar, akışın azaltılabileceği veya hiç olmadığı belirli girintilerde yoğunlaşmıştır (Şekil 4H, J), bu da ortamın akışı nedeniyle akışa maruz kalan doku yüzeyinden yerinden çıkmış olabileceklerini düşündürmektedir3. Şekil 1: Akış sisteminin kurulumu . (A) Rezervuar ve beş akış odasından oluşan monte edilmiş akış sistemi, peristaltik pompalardan birine bağlanır. Sağ tarafta, eksplantların statik olarak kültürlendiği altı oyuklu bir plaka bulunur. (B,C) Her iki yetiştirme yöntemi için de plasental numuneler, yaklaşık 0.5cm2’lik villöz eksplantlara diseke edilir, bunlardan daha sonra oyuk veya oda başına dört eksplant kullanılır. Deneysel bir yaklaşımda, beş oda veya kuyu kullanılır. (D,E) Akış kültürü için, eksplantları sabitlemek için dar iğne şeklindeki yüksekliklere sahip metal bir plaka kullanılır. (F,G) Tüplerin açıklıkları odacıkların başında bulunur ve bu nedenle dokunun doğrudan akışa maruz kalmasını sağlamak için baş aşağı kullanılır. Bu rakam Kupper ve ark.3’ten alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Plasental villöz eksplantların akış ve statik kültür üzerine morfolojik analizi. (A-E) Kültür üzerine eksplantların hücre iskeletini görselleştirmek için β-aktin için immünofloresan boyama. Analiz için, slayt başına rastgele seçilen altı nokta kullanıldı. Temsili resimler gösterilir. (A) Hazırlandıktan hemen sonra gömülü doku hücre iskeletinin görselleştirilmesi. Ölçek çubuğu: 20 μm. (BE) Aktin hücre iskeletinin hem zamana bağlı hem de yetiştirme moduna bağlı dejenerasyonunun kültürlenmiş akış ve statik kültür eksplantlarında temsili tasviri. (C-E) Yıldız işaretleri, aktin hücre iskeleti bozulmasının bir göstergesi olan aktin mikrofilament birikiminin arttığını gösterir. (F-J) Villöz eksplantların hematoksilen-eozin boyaması. Ölçek çubuğu: 100 μm. (F,G) 24 saat (G) boyunca taze gömülü doku (F) ve akış kültürü eksplantları, villöz bir eksplantın iyi korunmuş bir morfolojisini gösterir. (I) 48 saat boyunca akış kültürlü eksplantlar, sinsitiyotrofoblastın aralıklı olarak ayrılmış alanlarını gösterir (ok). (H,J) Statik eksplant kültüründen sonra yapısal bütünlüğün zamana bağlı bozulması, sinsitiyotrofoblastın (ok) ve delikli stroma’nın yerinden çıkması ile gösterilir. (K-O) CD34 II, villöz endotel hücrelerini boyamak için kullanıldı. Ölçek çubuğu: 100 μm. (K,L) Akış koşulları (L) altında 24 saat boyunca kültürlenen taze doku (K) ve eksplantlar, karakteristik yapısal olarak hizalanmış bir endotel hücre modeli sergiler. (N) Akım kültüründe 48 saat sonra vasküler bütünlük bir dereceye kadar azalır. (M,O) Statik kültürde, çökmüş kan damarları 24 saat (M) sonra zaten görülebilir ve bunun daha uzun statik ekim süresi (O) ile arttığı gözlemlenmiştir. Bu rakam Kupper ve ark.3’ten alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak villöz eksplantların ultrastrüktürel öncesi ve sonrası incelemesi. Görüntüleri analiz etmek için üç bağımsız deneyden elde edilen doku kullanıldı. (A) Yeni gömülmüş dokunun temsili bir görüntüsü, sinsitiyotrofoblastın (ST) yüzeyinde büyük miktarda mikrovillus (MV) gösterir. Yapısal olarak sağlam kılcal damarlar (Ca) iyi korunmuş stromada (S) görülebilir. (B) 24 saat boyunca statik olarak kültürlenen dokuda, bazı bölgelerde bazal membrandan kopmuş gibi görünen sinsityotrofoblastın yapısal bütünlüğünde bir bozulma vardır. Ayrıca gözle görülür bir lipit damlacıkları (LD) birikimi vardır. (C) Statik kültürde 48 saat sonra, ciddi ultrastrüktürel bozulma gözlenir. Stroma ve sinsityotrofoblast deliklidir ve büyük bir lipit damlacıkları birikimi belirgindir. Kan damarları neredeyse hiç izlenemiyordu. (D,E) Akış kültüründen alınan dokunun üst yapısı, 24 saat (D) ve 48 saat (E) sonra nispeten iyi korunmuştur. Ölçek çubuğu: 2 μm. MV: Mikrovillus, ST: Sinsitiotrofoblast, S: Stroma, Ca: Kılcal, LD: Lipid damlacıkları. Bu rakam Kupper ve ark.3’ten alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak villöz eksplantların ultrastrüktürel uygulama öncesi ve sonrası incelemesi. (A,C,E,G,I) Plasentalı villöz ağaçlarının yüzeyinin ilgili ayrıntılı görüntülerle (B,D,F,H,J) genel görünümü. (A,B) Yeni gömülmüş doku, yoğun bir mikrovillus dikişi sergiler. (B) Veziküler benzeri yapılar bazı yerlerde fark edilebilir. (C-F) Statik kültürde 24 saat ve 48 saat sonra, sinsitiyotrofoblastın yüzeyindeki mikrovilluslarda bir azalma görülür. Çarpıcı olan, eksplantın yüzeyinde veziküler benzeri parçacıkların yoğun bir şekilde birikmesidir. (F) Parçacıklar statik kültürde 48 saat sonra soluyor gibi görünüyor. (G-J) Akış kültüründen gelen dokunun yüzeyi, statik kültüre kıyasla 24 saat (G, H) ve 48 saat (I, J) sonra daha iyi korunmuş gibi görünmektedir. Mikrovilluslar, taze dokuda olduğu gibi aynı yüksek yoğunlukta olmasa da, yüzeyde (H,J) görülebilir. (B) Veziküler parçacıklar, akışı azaltılmış nişlere dağılmış olarak görülebilir. Bu rakam Kupper ve ark.3’ten alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Tablo 1: Plasental villöz akış ve statik kültür için deneysel ayarlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Tablo 2: Akış ve statik sistemin özellikleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Tablo 3: Bu çalışma için kullanılan immünohistokimya ve immünofloresan için antikorlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.