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Developmental Biology

Ex Vivo Culture en flux d’explants placentaires - Imiter les conditions dynamiques in utero

Published: September 08, 2023
doi:
10.3791/65919
, , , ,
1Division of Cell Biology, Histology and Embryology, Gottfried Schatz Research Center,Medical University of Graz

Summary

Voici un protocole pour la culture d’explants placentaires dans des conditions de débit constant. Cette approche améliore les systèmes traditionnels de culture de villes statiques en permettant la réplication d’environnements physiologiques dynamiques.

Abstract

Les modèles existants de culture d’explants placentaires ex vivo sont principalement basés sur des systèmes de culture statique utilisant des plaques de puits. Cependant, ces modèles ne reflètent pas de manière adéquate la dynamique in utero , où le placenta subit une légère contrainte de cisaillement constante due au plasma ou au flux sanguin. Pour remédier à cette limitation, un système de culture en flux a été conçu pour rapprocher la culture ex vivo d’explants placentaires des conditions d’écoulement in utero rencontrées dans le corps maternel. Dans le cadre de cette approche, les explants placentaires sont cultivés dans une séquence de cinq chambres d’écoulement interconnectées. Ce réglage permet de maintenir les concentrations physiologiques d’oxygène et un débit constant. Les données recueillies révèlent que dans des conditions d’écoulement, la préservation de la morphologie tissulaire présente une amélioration notable par rapport aux méthodes statiques conventionnelles. Cette technique innovante introduit un moyen simple de culture d’explants placentaires ex vivo, offrant une représentation plus fidèle de l’environnement dynamique in vivo . De plus, cette étude introduit de nouvelles possibilités pour étudier la dynamique fonctionnelle de l’interface fœto-maternelle. En adoptant des méthodologies dynamiques réalisables, une compréhension plus approfondie de la biologie placentaire est facilitée, soulignant sa pertinence pour la santé materno-fœtale.

Introduction

Depuis les années 1960, la culture d’explants placentaires au fond d’une plaque de puits est utilisée pour étudier l’interface fœto-maternelle 1,2,3. Cette méthode est bien établie et simple, permettant l’utilisation de tissus humains pour diverses études, en plus des cultures de cellules individuelles 2,3. Au fil du temps, les plans expérimentaux pour les cultures d’explants placentaires ont été modifiés en ce qui concerne la concentration en oxygène4 et pour empêcher le tissu de se déposer au fond de la plaque du puits 2,5,6. Cependant, cette méthode n’a pas été adaptée aux conditions in vivo dans l’utérus, en particulier la présence d’un flux constant3.

Le succès d’une grossesse dépend d’une perfusion adéquate et constante de l’espace intervilleux avec le sang maternel, établissant un circuit dynamique avec un flux et un écoulement continus de sang et de substances transmissibles par le sang 7,8,9,10,11,12. Le placenta comporte deux systèmes d’approvisionnement en sang distincts, l’un pour le sang maternel et l’autre pour le sang fœtal, ce qui entraîne une double perfusion par les systèmes fœtal et maternel13. Le sang maternel commence à perfuser l’espace intervilleux du placenta à la fin du premier trimestre, s’écoulant lentement à travers les artères spirales utérines élargies10,11,14. Par conséquent, les villosités placentaires sont baignées dans le sang maternel, fournissant des nutriments et de l’oxygène au fœtus. Ce sang maternel circule dans l’espace intervilleux avant de retourner dans la circulation maternelle via les veines utéroplacentaires. Lors de son passage dans l’espace intervilleux, la diffusion et l’absorption active de l’oxygène et des nutriments dans le sang fœtal entraînent une baisse des niveaux d’oxygène et de nutriments dans le sang maternel12,15. Cependant, le sang de l’espace intervilleux est entièrement remplacé par du sang frais et riche en oxygène environ deux à trois fois par minute, ce qui assure un apport continu de nutriments et de gaz13. Notamment, le syncytiotrophoblaste, la partie la plus externe de la barrière placentaire, est le seul composant de l’arbre villeux placentaire directement exposé au sang maternel15,16,17. Par conséquent, le syncytiotrophoblaste subit une légère contrainte de cisaillement constante de la part du sang maternelqui coule 3,14.

Les connaissances scientifiques actuelles concernant l’environnement du flux placentaire et les progrès techniques modernes permettent maintenant une culture adaptée et physiologiquement approximative des explants placentaires dans des conditions d’écoulement. De plus, les preuves suggèrent que les forces de cisaillement influencent les fonctions biologiques du syncytiotrophoblaste 18,19,20,21. Une approche bien connue qui tient compte du flux sanguin est le système de perfusion placentaire à double lobe22. Cependant, ces expériences nécessitent une expertise importante, sont limitées dans le temps (menées pendant quelques heures seulement) et ne sont réalisables qu’avec des échantillons placentaires du troisième trimestre 3,23. En revanche, nous avons développé une technique simple et non intrusive pour la culture ex vivo d’explants de villes placentaires dans des contextes de débit constant, s’adaptant à la fois aux tissus placentaires du premier et du troisième trimestre3. Dans cette configuration, les explants placentaires sont cultivés dans cinq chambres d’écoulement connectées en série. Les explants villeux sont fixés au fond de la chambre à l’aide d’élévations en forme d’aiguille sur de fines plaques métalliques. Le circuit d’écoulement construit est ensuite transféré dans un bioréacteur, où la concentration d’oxygène et le débit sont régulés3. Les résultats de la culture en flux démontrent que l’intégrité des tissus est mieux préservée par rapport à la méthode statique généralement utilisée3. De plus, cette approche dynamique permet d’obtenir des plans expérimentaux nouveaux et adaptés pour la culture d’explants tissulaires, ce qui permet des expériences in vitro qui imitent plus fidèlement l’environnement naturel3.

Protocol

Le comité d’éthique de l’Université de médecine de Graz a approuvé cette étude (31-019 ex 18/19 version 1.2 et 29-319 ex 16/17). Le consentement éclairé de tous les sujets participant à l’étude a été obtenu. 1. Préparation de l’expérience d’écoulement NOTE : Les expériences sont menées dans un bioréacteur avec des pompes péristaltiques intégrées (voir tableau des matériaux). L’humidité, la température et le niveau de gaz à l’intérieur du bioréacteur peuvent être ajustés. Allumez le bioréacteur et prenez toutes les dispositions préalables (par exemple, l’étalonnage des pompes, le préchauffage, les conditions de gaz et l’humidité) pour l’expérience conformément au manuel du bioréacteur. Avant de commencer l’expérience, les réglages requis (température, teneur en gaz, humidité) doivent être stabilisés pendant quelques heures ou toute la nuit. Pour ce faire, démarrez le bioréacteur et le logiciel, puis cliquez sur Modifier les points de consigne sous l’élément de menu « Incubateur ». Préchauffer le PBS et le milieu requis (milieu de croissance des cellules endothéliales complété par les suppléments fournis hEGF-5, HC-500 ainsi que 5 % de sérum de veau fœtal appauvri en exosomes, 1 % de pénicilline/streptomycine) (voir tableau des matériaux) jusqu’à 37 °C.​ 2. Dissection d’un échantillon placentaire Immédiatement après l’accouchement, prélevez trois fois 2 cm 3 échantillons placentaires dans la région médio-placentaire, comme décrit dans Kupper etcoll.3 Brièvement, conservez les échantillons dans le PBS. Éliminez la plaque choriale, les caduques maternelles et les zones d’infarctus visibles de l’échantillon. Disséquer le reste de l’échantillon de tissu en explants villeux d’un diamètre de section transversale d’environ 0,5 cm (poids humide d’environ 7,5 mg). Transférez-les dans une boîte de Pétri avec du PBS frais. Lavez les explants dans du PBS en les secouant doucement dans le liquide avec une pince à épiler pour éliminer les résidus de sang.REMARQUE : Disséquez les échantillons dans une boîte de Pétri avec du PBS pour les prélaver et les empêcher de se dessécher et utilisez des outils stérilisés/autoclavés pour traiter les tissus. 3. Expérience d’écoulement Sous une hotte stérile, connectez cinq chambres en série à la bouteille réservoir à l’aide des verrous Luer conformément au manuel d’utilisation des chambres d’écoulement (voir tableau des matériaux).REMARQUE : Stérilisez et/ou autocchez tous les matériaux avant utilisation, conformément au manuel respectif. Utilisez un filtre à air sur le flacon-réservoir pour un échange gazeux stérile. Pour ouvrir et fermer les chambres, pressez doucement les pattes des chambres. Étape 3.1. peut également être préparé plus tôt. Retournez les chambres et ouvrez-les en retirant le fond. Utilisez une pince pour transférer les plaques métalliques au centre de la partie supérieure des chambres avec les goupilles pointant vers le haut. Remplir les chambres avec 1 mL de milieu préchauffé (37 °C). Remplissez ensuite le réservoir avec 20 ml supplémentaires. Le circuit nécessite un total de 25 mL, y compris le volume dans chaque chambre d’écoulement, dans les tubes et la bouteille réservoir. Sous l’écoulement, le volume final du milieu dans une chambre remplie est de 2 mL. Utilisez une pince et transférez un explant villeux après l’autre entre les aiguilles de la plaque métallique dans la chambre. Laissez glisser les aiguilles entre les villosités placentaires pour éviter la perforation du tissu. Transférez quatre explants dans une chambre. Fermez les chambres en remettant le fond en place avec précaution. Un circuit complet contient un total de 20 explants. Les chambres doivent rester à l’envers.REMARQUE : Saisissez doucement les explants avec la pince ; Essayez de ne pas les serrer. Assurez-vous que les chambres et le circuit sont complètement scellés pour éviter les fuites. Les chambres sont toujours utilisées à l’envers. Le nombre d’explants par chambre et le nombre de chambres elles-mêmes sont variables. La procédure pour le tissu du premier trimestre est similaire à celle du tissu du troisième trimestre avec un petit ajout : pour fixer les villosités, pliez légèrement les aiguilles sur les explants après que le tissu a été transféré sur la plaque métallique (communication personnelle Brugger et al.). Cela permet de fixer les tissus fragiles sur la plaque métallique et d’éviter que les échantillons ne glissent. Transférez l’ensemble d’écoulement dans le bioréacteur. Connectez le circuit d’écoulement à la pompe péristaltique à l’intérieur du bioréacteur en connectant le tube de la pompe à la pompe. Fixez-le sur la 4èmeétape ( on l’entendra cliquer quatre fois). Si un contrôle statique est nécessaire, placez également la plaque de puits dans le bioréacteur.NOTA : Pour la culture statique, cinq puits d’une plaque à six puits sont remplis de 4 mL de milieu par puits et de 4 explants de villes par puits. La plaque de puits remplie est également placée dans le bioréacteur et cultivée dans la même atmosphère que les explants de culture en flux. De plus amples détails sont décrits dans Kupper et al.3 Réglez le mode de pompe sur Manuel sous l’élément de menu « Pompes ». Réglez ensuite la vitesse de la pompe à 1 mL/min et commencez à pomper le fluide dans le tube en cliquant sur Exécuter. Pendant que le circuit est rempli de fluide, tenez les chambres à un angle de manière à ce qu’elles soient complètement remplies de fluide.NOTA : Voir le tableau supplémentaire 1 pour les paramètres expérimentaux de l’écoulement villeux placentaire et de la culture statique. Les spécifications du système d’écoulement et du système statique sont fournies dans le tableau supplémentaire 2.ATTENTION : Inclinez soigneusement la chambre pendant le remplissage pour éviter que les échantillons ne glissent des aiguilles. Une fois le remplissage terminé, les chambres restent à l’envers. Assurez-vous que les chambres sont bien droites et bien droites, et fermez les deux couvercles du bioréacteur.REMARQUE : Le volume final du fluide dans une chambre d’écoulement remplie est de 2 mL. Les paramètres expérimentaux et les spécifications des chambres d’écoulement et des plaques de puits utilisées dans les expériences sont décrits dans Kupper et al.3 Incubez le tissu pendant le temps souhaité.REMARQUE : La température, le niveau de gaz et le débit peuvent être surveillés sur l’ordinateur sans ouvrir à nouveau le couvercle du bioréacteur. Arrêtez la pompe après l’incubation du tissu pendant le temps souhaité en cliquant sur Abandonner sous l’élément de menu « Pompes ». Ouvrez les deux couvercles du bioréacteur, puis une chambre d’écoulement à la fois. Retirez délicatement les explants de la plaque métallique à l’aide d’une pince. Traiter le tissu et le surnageant selon l’analyse en aval sélectionnée. Dans ce cas, une coloration immunohistochimique et une microscopie électronique ont été réalisées3. Voir le tableau supplémentaire 3 pour plus de détails sur les anticorps utilisés pour l’immunohistochimie et l’immunofluorescence.REMARQUE : Après avoir retiré le tissu, vidangez le fluide du circuit en tournant la pompe dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Démontez et nettoyez le circuit d’écoulement conformément aux instructions du fabricant pour les chambres d’écoulement et les tuyaux.

Representative Results

Des parties de cette publication et de ses résultats ont déjà été publiées (voir références 3 et 23). Dispositif expérimentalUn dispositif expérimental est illustré à la figure 1. Un cycle d’écoulement composite comprend cinq chambres d’écoulement qui sont interconnectées en série (Figure 1A). À l’intérieur de chaque chambre d’écoulement, quatre explants, chacun d’un diamètre de section transversale d’environ 0,5 cm, sont cultivés (Figure 1 A,C). Pour l’expérience de contrôle statique, les explants sont cultivés dans des puits individuels d’une plaque à six puits (figure 1B). Pour éviter que les explants ne soient évacués, ils sont fixés sur des plaques métalliques présentant d’étroites protubérances en forme d’aiguille (Figure 1 D,E). Afin de soumettre les explants à un écoulement direct du milieu, les chambres sont inversées, les entrées et les sorties étant positionnées au niveau de la section de tête (Figure 1 F,G). À l’intérieur du bioréacteur, le cycle d’écoulement est lié à une pompe péristaltique. Dans le but de comparer l’intégrité tissulaire entre les tissus cultivés en flux et les tissus cultivés statiquement conventionnellement, les explants sont placés dans une plaque à six puits adjacente au cycle d’écoulement. Cela permet de vérifier des conditions de culture cohérentes en termes d’oxygène, de température et d’humidité (Figure 1A)3. Analyse morphologique β-actineDiverses procédures de coloration immunohistochimique ont été effectuées pour examiner les distinctions histologiques dans l’intégrité des tissus associées à diverses conditions de culture (Figure 2). Les explants qui ont été rapidement intégrés après la dissection ont servi de référence de référence. Pour l’analyse du cytosquelette d’actine dans les explants villeux, une coloration à la β-actine a été réalisée (Figure 2A-E). L’analyse descriptive a révélé une présentation visuelle bien structurée et organisée du cytosquelette dans les tissus fraîchement obtenus (Figure 2A). Au fil du temps, au fur et à mesure que la culture progressait, il y avait une agrégation observable de microfilaments, signifiant une dégradation de la structure du cytosquelette. Ce phénomène a été systématiquement observé dans les explants villeux qui ont subi une culture statique3 (Figure 2C,E, indiquée par des astérisques). Coloration H&ELa coloration H&E a renforcé l’observation selon laquelle l’intégrité des tissus diminue au cours de la culture statique, une tendance qui s’améliore dans le contexte de la culture en flux (Figure 2F-J). Les tissus frais présentaient une présentation histologique structurée et caractéristique des explants villeux, caractérisés par un stroma dense et serré (Figure 2F). De plus, le syncytiotrophoblaste était fermement collé au stroma sous-jacent (Figure 2F). Un aspect comparable a été observé chez des explants villeux cultivés dans un environnement d’écoulement pendant 24 h (Figure 2G). Cependant, après 48 h de culture sous l’écoulement, on a observé que des parties du syncytiotrophoblaste étaient partiellement détachées (figure 2I, indiquée par une flèche), accompagnées de petites lacunes sporadiques dans le stroma. L’examen histologique du tissu a révélé que l’intégrité du tissu après 24 h dans des conditions de culture statique n’était pas suffisamment préservée (figure 2H). De plus, cette intégrité s’est encore nettement dégradée après 48 h en culture statique (Figure 2J). Le stroma présentait un aspect poreux et piqué, et un détachement significatif du syncytiotrophoblaste du stroma était évident dans les régions plus grandes (figure 2J, flèches)3. CD34IILa coloration CD34II a été utilisée pour visualiser les cellules endothéliales et, par conséquent, les vaisseaux sanguins fœto-placentaires dans les explants villeux (Figure 2K-O). Les tissus qui ont été directement incrustés juste après la dissection présentaient une disposition distinctement organisée des cellules endothéliales (Figure 2K). L’intégrité morphologique des vaisseaux sanguins fœto-placentaires est demeurée bien maintenue après 24 h de culture en flux et souvent même après 48 h, bien que des cas occasionnels d’affaissement des vaisseaux sanguins aient été observés dans des conditions d’écoulement (Figure 2 L,N). Cependant, après 24 h de culture statique, les vaisseaux sanguins présentaient un affaissement partiel, comme en témoigne leur aspect visuel perturbé (figure 2M, indiquée par des pointes de flèches). Cette détérioration des vaisseaux sanguins dans le cadre de la culture statique semblait s’exacerber avec le temps de culture prolongé. En résumé, l’évaluation morphologique descriptive des explants villeux après la culture en flux et la culture statique a indiqué que l’intégrité des tissus semble être préservée plus efficacement dans le système d’écoulement lorsqu’elle est comparée au mode de culture statique3. Analyse ultrastructurale du tissu cultivé Microscopie électronique à transmissionAfin d’effectuer un examen plus détaillé de la morphologie des explants villeux, des analyses ultrastructurales supplémentaires ont été effectuées à l’aide de la microscopie électronique à transmission (MET) (Figure 3A-E). Ces résultats ont corroboré les résultats des investigations histologiques. Dans les tissus qui ont été directement incrustés immédiatement après la préparation, la morphologie a été exceptionnellement bien préservée (Figure 3A). Des microvillosités étaient clairement discernables à la surface du syncytiotrophoblaste. Le syncytiotrophoblaste présentait sa couche continue distinctive sans limites cellulaires latérales, établissant un contact direct avec la membrane basale. Le stroma du tissu frais présentait un empilement dense sans perforations ni ruptures significatives. De plus, l’aspect ultrastructural des vaisseaux sanguins et des érythrocytes intravasculaires individualisés a également démontré une excellente conservation (Figure 3A). Même après 24 h de culture en flux, la morphologie globale des échantillons de tissus est demeurée relativement bien maintenue (Figure 3D). Bien qu’il y ait eu un peu moins de microvillosités à la surface du syncytiotrophoblaste par rapport aux tissus frais, le syncytiotrophoblaste est resté principalement attaché à la membrane basale. Des noyaux et parfois de petites vacuoles ont été observés dans la partie interne du syncytiotrophoblaste. Le stroma à l’intérieur des villosités placentaires semblait bien conservé et ressemblait beaucoup à du tissu frais (Figure 3D). Même après 48 h de culture en flux, les cellules stromales présentaient une conservation relativement bonne, bien qu’avec quelques perforations présentes (Figure 3E). Curieusement, des gouttelettes lipidiques ont été détectées dans les tissus. Alors que le syncytiotrophoblaste présentait des vacuoles et une réduction du nombre de microvillosités, il restait attaché à la membrane basale dans de nombreuses régions, et les noyaux syncytiaux et cellulaires étaient clairement visibles (Figure 3E). Contrairement aux tissus de la culture en flux, la morphologie des tissus villeux soumis à la culture statique s’est détériorée dès 24 h (figure 3B). Le syncytiotrophoblaste s’est dissocié de la membrane basale à plusieurs endroits et présentait des perforations relativement importantes. De plus, des gouttelettes lipidiques étaient fréquemment mises en évidence à la fois dans le syncytiotrophoblaste et dans le stroma (Figure 3B). Après 48 h de culture statique, un déclin progressif de l’ultrastructure a été observé (Figure 3C). Le syncytiotrophoblaste présentait de nombreuses perforations et un détachement de la membrane basale dans une mesure considérable. L’identification des cellules du stroma, ainsi que des cellules endothéliales composant les vaisseaux sanguins, est devenue difficile. De plus, il y avait une accumulation notable de gouttelettes lipidiques dans les explants villeux après 48 h de culture statique (Figure 3C). En résumé, l’ultrastructure des tissus en culture statique a montré des détériorations successives au cours de la période de culture, tendance qui a été atténuée par la culture dans des conditions d’écoulement3. Microscopie électronique à balayageÀ l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB), un examen détaillé de la surface des explants villeux a été facilité (Figure 4A-J). Les tissus qui venaient d’être incrustés présentaient un réseau densément peuplé de microvillosités à sa surface (Figure 4 A,B). Certaines régions présentaient des structures en forme de vésicules. En revanche, les tissus de la culture statique ont manifesté une réduction substantielle des microvillosités après 24 h (Figure 4C,D), une réduction qui a persisté après 48 h (Figure 4E,F). Alors que certaines zones présentaient une agrégation de structures ressemblant à des vésicules qui n’avaient pas été libérées, d’autres régions semblaient dénudées et érodées (Figure 4D,F). Dans les tissus soumis à la culture en flux, les microvillosités étaient encore présentes à la surface après 24 h (Figure 4G,H), ainsi qu’après 48 h (Figure 4I,J), bien que dans une moindre mesure que dans les tissus frais. Par rapport à la culture statique, la prévalence des structures en forme de vésicule à la surface a diminué. Curieusement, ces structures en forme de vésicules étaient particulièrement concentrées dans des cavités spécifiques où le débit pouvait être réduit ou absent (Figure 4H,J), ce qui suggère qu’elles pourraient avoir été délogées de la surface tissulaire exposée à l’écoulement en raison de l’écoulement du milieu3. Figure 1 : Mise en place du système d’écoulement. (A) Le système d’écoulement assemblé, composé du réservoir et de cinq chambres d’écoulement, est relié à l’une des pompes péristaltiques. Sur le côté droit se trouve une plaque à six puits dans laquelle les explants sont cultivés statiquement. (B,C) Pour les deux méthodes de culture, les échantillons placentaires sont disséqués en explants villeux d’environ 0,5 cm2, dont quatre explants sont ensuite utilisés par puits ou chambre. Dans une approche expérimentale, cinq chambres ou puits sont utilisés. (D,E) Pour la culture en flux, une plaque métallique avec des élévations étroites en forme d’aiguille est utilisée pour fixer les explants. (F,G) Les ouvertures des tubes sont situées à la tête des chambres, et sont donc utilisées à l’envers pour garantir que le tissu est exposé à l’écoulement direct. Cette figure est reproduite à partir de Kupper et al.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Analyse morphologique des explants de villes placentaires lors de l’écoulement et de la culture statique. (A-E) Marquage par immunofluorescence de la β-actine pour visualiser le cytosquelette des explants lors de la culture. Pour l’analyse, six spots choisis au hasard ont été utilisés par lame. Des images représentatives sont présentées. (A) Visualisation du cytosquelette des tissus incorporés directement après la préparation. Barre d’échelle : 20 μm. (B-E) Représentation représentative de la dégénérescence du cytosquelette d’actine du cytosquelette d’actine en fonction du temps et du mode de culture dans des explants cultivés de culture en flux et en culture statique. (C-E) Les astérisques signifient une augmentation de l’accumulation de microfilaments d’actine, ce qui est une indication de la dégradation du cytosquelette d’actine. (F-J) Coloration à l’hématoxyline-éosine des explants villeux. Barre d’échelle : 100 μm. (F,G) Des explants de tissus fraîchement incrustés (F) et de culture en flux pendant 24 h (G) montrent une morphologie bien conservée d’un explant villeux. (I) Les explants cultivés en flux pendant 48 h montrent des zones détachées par intermittence du syncytiotrophoblaste (flèche). (H,J) Détérioration de l’intégrité structurale en fonction du temps après une culture statique de l’explantation, indiquée par le déplacement du syncytiotrophoblaste (flèche) et du stroma perforé. (K-O) CD34 II a été utilisé pour colorer les cellules endothéliales villeuses. Barre d’échelle : 100 μm. (K,L) Les tissus frais (K) et les explants cultivés pendant 24 h dans des conditions d’écoulement (L) présentent un motif de cellules endothéliales structurellement alignées caractéristiques. (N) Après 48 h en culture flow, l’intégrité vasculaire diminue dans une certaine mesure. (M,O) Dans la culture statique, les vaisseaux sanguins affaissés sont déjà visibles après 24 h (M), ce qui augmente avec un temps de culture statique plus long (O). Cette figure est reproduite à partir de Kupper et al.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Examen ultrastructural avant et après la culture d’explants villeux par microscopie électronique à transmission. Des tissus provenant de trois expériences indépendantes ont été utilisés pour analyser les images. (A) Une image représentative d’un tissu fraîchement incrusté montre une grande quantité de microvillosités (MV) à la surface du syncytiotrophoblaste (ST). Des capillaires (Ca) structurellement intacts sont visibles dans le stroma (S) bien conservé. (B) Dans le tissu qui a été cultivé statiquement pendant 24 h, il y a une détérioration de l’intégrité structurale du syncytiotrophoblaste, qui semble être déconnecté de la membrane basale à certains endroits. Il y a aussi une accumulation notable de gouttelettes lipidiques (LD). (C) Après 48 h en culture statique, une détérioration ultrastructurale sévère est observée. Le stroma ainsi que le syncytiotrophoblaste sont perforés et une accumulation massive de gouttelettes lipidiques est évidente. Les vaisseaux sanguins pouvaient à peine être tracés. (D,E) L’ultrastructure du tissu issu de la culture en flux était relativement bien préservée après 24 h (D) ainsi qu’après 48 h (E). Barre d’échelle : 2 μm. MV : Microvillosités, ST : Syncytiotrophoblaste, S : Stroma, Ca : Capillaire, LD : Gouttelettes lipidiques. Cette figure est reproduite à partir de Kupper et al.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Examen ultrastructural avant et après la culture d’explants villeux par microscopie électronique à balayage. (A,C,E,G,I) Images d’ensemble de la surface des villoux placentaires avec images détaillées respectives (B, D, F, H, J). (A,B) Les tissus fraîchement incrustés présentent une couture dense de microvillosités. (B) Des structures de type vésiculaire peuvent être remarquées à certains endroits. (C-F) Après 24 h et 48 h en culture statique, une diminution des microvillosités à la surface du syncytiotrophoblaste est visible. Ce qui frappe, c’est l’accumulation importante de particules de type vésiculaire à la surface de l’explant. (F) Les particules semblent se flétrir après 48 h en culture statique. (G-J) La surface du tissu issue de la culture en flux semble être mieux préservée après 24 h (G,H) ainsi qu’après 48 h (I,J) par rapport à la culture statique. Les microvillosités sont visibles à la surface (H,J), mais pas dans la même densité élevée que dans le tissu frais. (B) On peut voir des particules vésiculaires dispersées dans les niches à débit réduit. Cette figure est reproduite à partir de Kupper et al.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Tableau supplémentaire 1 : Paramètres expérimentaux pour le flux villeux placentaire et la culture statique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Tableau supplémentaire 2 : Spécifications du système d’écoulement et du système statique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Tableau supplémentaire 3 : Anticorps pour l’immunohistochimie et l’immunofluorescence utilisés pour cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette étude présente une perspective unique sur une technique de culture en flux pour les explants placentaires conçue pour reproduire la dynamique de l’environnement in utero 3,23. Les résultats révèlent que la morphologie des tissus cultivés dans des conditions d’écoulement est mieux préservée par rapport à la méthode traditionnelle de culture statique3. Notamment, même si ni les conditions de culture statique ni les conditions de culture en flux ne facilitent la perfusion des vaisseaux placentaires, la destruction des vaisseaux sanguins fœto-placentaires à l’intérieur du stroma villeux a été principalement observée en culture statique, alors que l’intégrité des vaisseaux sanguins semblait être mieux maintenue sur une plus longue durée en culture en flux3.

Une explication possible de cette observation pourrait être liée au rôle protecteur et endocrinien crucial du syncytiotrophoblaste, une fonction bien documentée dans la littérature 12,24,25,26. Compte tenu de cela, il est concevable que l’intégrité globale de la couche externe des villosités contribue de manière significative au maintien du stroma sous-jacent, y compris les vaisseaux sanguins. Par conséquent, l’intégrité cellulaire soutenue des vaisseaux sanguins dans des conditions d’écoulement pourrait être attribuée à l’écoulement continu du milieu. Ce mouvement facilite le mouvement passif des explants, facilitant l’échange de gaz, de nutriments et de nanoparticules (comme les vésicules extracellulaires) à travers la barrière placentaire. Ceci, à son tour, pourrait avoir un impact positif sur la préservation de la morphologie des vaisseaux sanguins. De plus, le phénomène de mécanosensation joue un rôle dans la morphogenèse tissulaire à travers divers tissus27,28. Des études ont démontré que la mécanosensibilité influence les processus cellulaires à plusieurs niveaux, déclenchant une gamme de réponses biochimiques qui influencent finalement la fonctionnalité des tissus et des organes29. Notamment, les protéines mécanosensibles sont exprimées par le syncytiotrophoblaste tout au long de la gestation28. De plus, l’étude suggère que les microvillosités à la surface des tissus peuvent être impliquées dans ce contexte28.

Une autre perspective qui mérite d’être prise en compte est le rôle potentiel des mitochondries dans la réponse cellulaire au flux. Par exemple, dans les cellules endothéliales, les mitochondries servent de transducteurs de signaux pour les réponses cellulaires aux stimuli environnementaux30. L’accumulation accrue de gouttelettes lipidiques, observée dans les tissus en culture statique par TEM3, a été associée à l’induction de l’apoptose en raison d’un dysfonctionnement mitochondrial31. D’autres recherches sont nécessaires pour dévoiler les mécanismes sous-jacents et les facteurs clés, en les reliant aux voies de signalisation en aval. Cette exploration pourrait améliorer notre compréhension de la façon dont le tissu perçoit et réagit à la contrainte de cisaillement, ce qui se traduirait par une amélioration de la viabilité et de l’intégrité des explants villeux en culture23.

Plusieurs étapes critiques du protocole doivent être réitérées et exécutées avec soin. Après l’expulsion placentaire, les tissus doivent être mis en culture le plus rapidement possible. Lors de la préparation de l’explantation, il est crucial d’éviter les zones présentant des infarctus visibles. Il est important de manipuler délicatement les explants avec des pinces pour éviter qu’ils ne se serrent. Il est recommandé de garder le tissu recouvert de liquide tout au long de la procédure et de le mener rapidement.

Il est important de reconnaître que cette étude n’est pas en mesure de spécifier la contrainte de cisaillement exacte dans le système d’écoulement présenté, ce qui devrait être considéré comme une limitation dans les recherches futures 3,23. Néanmoins, il est important de reconnaître que la vitesse d’écoulement précise et la contrainte de cisaillement pour un villosité placentaire spécifique in vivo sont influencées par de nombreux paramètres, tels que les caractéristiques géométriques de l’espace intervilleux, l’emplacement des villosités dans cet espace, ainsi que sa proximité et son angle avec les artères spirales maternelles et les veines utérines 3,19,23,32 . La complexité de la structure géométrique du placenta, qui varie d’un individu à l’autre, doit également être prise en compte23,32. Il existe déjà des modèles mathématiques estimant le flux sanguin dans l’espace intervilleux32 et des calculs sur la contrainte de cisaillement de la paroi sur le syncytiotrophoblaste 19,28. Il est intéressant de noter qu’une étude a prédit que la contrainte de cisaillement sur le syncytiotrophoblaste est plus faible au troisième trimestre par rapport au premier trimestre28, tandis qu’une autre a démontré une contrainte de cisaillement de paroi spatialement hétérogène sur le syncytiotrophoblaste19. Déterminer avec précision la vitesse d’écoulement et la contrainte de cisaillement pour une villosité placentaire spécifique reste un défi 3,19,23,32. De tels calculs offrent une approximation de la plage de contrainte de cisaillement pour des études futures, mais ils peuvent nécessiter des ajustements anatomiques continus et une optimisation23. De plus, les études futures pourraient mettre au point des techniques de culture en flux continu nouvelles et raffinées qui tiennent compte de la géométrie complexe de l’espace intervilleux et des stratégies pour augmenter le nombre de spécimens par expérience3. On s’attend à ce que le système d’écoulement progresse et se développe, avec l’utilisation possible d’autres chambres d’écoulement (Brugger et coll., données inédites, 2023).

En conclusion, cette étude jette des bases solides en démontrant une technique de culture ex vivo en flux facilement réalisable qui maintient l’intégrité structurelle des explants de villes en culture. Il souligne l’importance des techniques dynamiques dans les études de biologie fonctionnelle placentaire, ouvrant la voie à de nouvelles avancées dans les systèmes de culture en flux et à la génération de nouvelles idées et hypothèses 3,23.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Bettina Amtmann et Petra Winkler pour leur excellent soutien technique pour l’échantillonnage des tissus. Cette recherche a été financée par le Fonds scientifique autrichien FWF (DOC 31-B26) et l’Université de médecine de Graz, en Autriche, dans le cadre du programme de doctorat sur les troubles inflammatoires de la grossesse (DP-iDP).

Materials

6-well plates NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 140675
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA A21422 Diluted in PBS, 1:200
antibody diluent Dako, Santa Clara, CA, USA S3022
anti-β-actin (AC-15) Abcam, Cambridge, UK ab6276 Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000
Bioreactor TEB500 TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117
CD34 Class II (QBEnd-10) Dako, Santa Clara, CA, USA M7165 Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500
CPD 030 critically point dryer Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) Critically point dryer
DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA D21490 Diluted in PBS, 1:1000
Ebers TEB505 Series Software TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain  Series Software 1.4
Endothelial Cell Growth Medium MV PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany;  C-22120 Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used
Excelsior AS Tissue Processor  ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Exosome-depleted fetal bovine serum Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA A2720803
Histolab Clear Histolab, Askim, Sweden 14250-TY
Hydrogen Peroxide Block ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TA125H202Q
Kaiser’s Glycerin Gelatine Merck, Darmstadt, Germany 1092420100
Leica DM 6000 B microscope Leica, Wetzlar, Germany Equipped with an Olympus DP 72 Camera
Leica UC7 ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna, Austria)
Metal plate with needles In-house construction
Microtome  Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Microwave oven Miele, Guetersloh, Germany
Olympus microscope  (BX63) Olympus, Hamburg, Germany Serial Number: 1A52421
PBS ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Penicillin/Streptomycin  Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 2585627
Primary antibody enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TL-125-PB
ProLong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA P36934
Pumping tube Tygon, Bartelt, Graz, Austria 6.078 175  1.02 mm diameter 
QV500 Flow chambers Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK QV500  Other chambers would work as well
SCD 500, sputter coater Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein Sputter coater
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit Abcam, Cambridge, UK ab64252
Superfrost Plus slides  Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
Syringe Filter Corning Incorporated, NY, USA 431219 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle 
TAAB epoxy resin Agar Scientific, Stansted, Essex, UK T001
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer  ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TL-125-HL
UltraVision Protein Block ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TA125BPQ
Zeiss EM 900 transmission electron microscope Zeiss, Oberkochen, Germany
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope Zeiss, Cambridge, UK Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage
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References

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Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. Ex Vivo Placental Explant Flow Culture – Mimicking the Dynamic Conditions In Utero. J. Vis. Exp. (199), e65919, doi:10.3791/65919 (2023).
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