Ex Vivo Cultura do Fluxo de Explantes Placentários - Mimetizando as Condições Dinâmicas no Útero

Partes desta publicação e seus resultados já foram publicados (ver referências 3 e 23). Arranjo experimentalUm arranjo experimental é ilustrado na Figura 1. Um ciclo de escoamento composto é composto por cinco câmaras de fluxo que são interligadas em série (Figura 1A). Dentro de cada câmara de fluxo são cultivados quatro explantes, cada um com diâmetro transversal de aproximadamente 0,5 cm (Figura 1 A,C). Para o experimento controle estático, os explantes são cultivados em poços individuais de placa de seis poços (Figura 1B). Para evitar que os explantes sejam liberados, eles são afixados em placas metálicas com saliências estreitas em forma de agulha (Figura 1 D,E). Para submeter os explantes a um fluxo direto do meio, as câmaras são invertidas, com as entradas e saídas posicionadas na seção principal (Figura 1 F,G). Dentro do biorreator, o ciclo de fluxo está ligado a uma bomba peristáltica. Com o objetivo de comparar a integridade tecidual entre o tecido cultivado em fluxo e o tecido convencionalmente estático, os explantes são colocados em uma placa de seis poços adjacente ao ciclo de fluxo. Isso garante a verificação de condições de cultura consistentes em termos de oxigênio, temperatura e umidade (Figura 1A)3. Análise morfológica β-actinaVários procedimentos de coloração imuno-histoquímica foram realizados para examinar distinções histológicas na integridade tecidual associadas a diversas condições de cultivo (Figura 2). Explantes prontamente incluídos pós-dissecção serviram como referência basal. Para a análise do citoesqueleto da actina no interior dos explantes vilosos foi realizada a coloração β-actina (Figura 2A-E). A análise descritiva revelou uma apresentação visual bem estruturada e organizada do citoesqueleto no tecido recém-obtido (Figura 2A). Ao longo do tempo, à medida que o cultivo progredia, observava-se uma agregação de microfilamentos, significando uma degradação da estrutura do citoesqueleto. Esse fenômeno foi consistentemente observado em explantes vilosos submetidos a cultivo estático3 (Figura 2C,E, indicada por asteriscos). Coloração H&EA coloração H&E forneceu reforço adicional à observação de que a integridade tecidual diminui ao longo da cultura estática, uma tendência que é melhorada no contexto da cultura em fluxo (Figura 2F-J). O tecido fresco exibiu uma apresentação histológica estruturada e característica dos explantes vilosos, caracterizada por um estroma denso e firmemente compactado (Figura 2F). Além disso, o sinciciotrofoblasto estava firmemente aderido ao estroma subjacente (Figura 2F). Uma aparência comparável foi observada em explantes vilosos cultivados em ambiente de fluxo por 24 h (Figura 2G). Entretanto, após 48 h de cultivo sob o fluxo, observou-se que porções do sinciciotrofoblasto estavam parcialmente descoladas (Figura 2I, indicada por seta), acompanhadas de pequenas lacunas esporádicas no interior do estroma. O exame histológico do tecido indicou que a integridade do tecido após 24 h em uma condição de cultura estática estava inadequadamente preservada (Figura 2H). Além disso, essa integridade degradou-se acentuadamente após 48 h em cultura estática (Figura 2J). O estroma exibia aspecto poroso e esburacado, e importante descolamento do sinciciotrofoblasto do estroma era evidente em regiões maiores (Figura 2J, setas)3. CD34IIA coloração CD34II foi empregada para visualizar as células endoteliais e, consequentemente, os vasos fetoplacentários dentro dos explantes vilosos (Figura 2K-O). O tecido que foi diretamente incluído logo após a dissecção apresentou um arranjo distintivamente organizado das células endoteliais (Figura 2K). A integridade morfológica dos vasos fetoplacentários permaneceu bem mantida após 24 h de cultura de fluxo e frequentemente mesmo após 48 h, embora casos ocasionais de colapso de vasos sanguíneos tenham sido observados em condições de fluxo (Figura 2 L,N). No entanto, após 24 h de cultura estática, os vasos sanguíneos exibiram colapso parcial, evidenciado por sua aparência visual alterada (Figura 2M, indicada pelas pontas das setas). Essa deterioração dos vasos sanguíneos dentro do ambiente de cultura estática pareceu exacerbar-se com o tempo de cultivo prolongado. Em resumo, a avaliação morfológica descritiva dos explantes vilosos subsequentes à cultura de fluxo e estática indicou que a integridade tecidual parece ser preservada mais efetivamente dentro do sistema de fluxo quando contrastada com o modo de cultura estático3. Análise ultraestrutural do tecido cultivado Microscopia eletrônica de transmissãoPara um exame mais detalhado da morfologia dos explantes vilosos, análises ultraestruturais adicionais foram realizadas usando microscopia eletrônica de transmissão (MET) (Figura 3A-E). Esses achados corroboraram os resultados das investigações histológicas. No tecido que foi diretamente incluído imediatamente após o preparo, a morfologia foi excepcionalmente bem preservada (Figura 3A). As microvilosidades eram claramente discerníveis na superfície do sinciciotrofoblasto. O sinciciotrofoblasto apresentou sua distinta camada contínua sem limites celulares laterais, estabelecendo contato direto com a membrana basal. O estroma do tecido fresco exibiu tamponamento denso, sem perfurações ou rupturas significativas. Além disso, o aspecto ultra-estrutural dos vasos sanguíneos e os eritrócitos intravasculares individualizados também demonstraram excelente preservação (Figura 3A). Mesmo após 24 h de cultura em fluxo, a morfologia geral das amostras de tecido permaneceu relativamente bem mantida (Figura 3D). Enquanto havia um pouco menos de microvilosidades na superfície do sinciciotrofoblasto em comparação com o tecido fresco, o sinciciotrofoblasto permaneceu primariamente aderido à membrana basal. Núcleos e ocasionais pequenos vacúolos foram observados dentro da porção interna do sinciciotrofoblasto. O estroma dentro das vilosidades placentárias parecia bem preservado e muito parecido com tecido fresco (Figura 3D). Mesmo após 48 h de cultura em fluxo, as células estromais exibiram preservação relativamente boa, embora com algumas perfurações presentes (Figura 3E). Curiosamente, gotículas lipídicas foram detectadas no interior do tecido. Enquanto o sinciciotrofoblasto exibia vacúolos e redução no número de microvilosidades, ele permanecia aderido à membrana basal em várias regiões, e os núcleos sincicial e celular eram claramente visíveis (Figura 3E). Em contraste com o tecido da cultura em fluxo, a morfologia do tecido viloso submetido à cultura estática exibiu deterioração tão cedo quanto 24 h (Figura 3B). O sinciciotrofoblasto dissociava-se da membrana basal em múltiplos locais e apresentava perfurações relativamente substanciais. Além disso, gotículas lipídicas foram frequentemente evidentes tanto no sinciciotrofoblasto quanto no estroma (Figura 3B). Após 48 h de cultura estática, um declínio progressivo da ultraestrutura foi aparente (Figura 3C). O sinciciotrofoblasto apresentou numerosas perfurações e descolamento da membrana basal em grande extensão. A identificação das células do estroma, bem como das células endoteliais que compõem os vasos sanguíneos, tornou-se um desafio. Além disso, houve um notável acúmulo de gotículas lipídicas no interior dos explantes vilosos após 48 h de cultura estática (Figura 3C). Em resumo, a ultraestrutura do tecido em cultura estática exibiu deterioração sucessiva ao longo do período de cultivo, tendência que foi atenuada pelo cultivo em condições de fluxo3. Microscopia eletrônica de varreduraUtilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV), um exame detalhado da superfície dos explantes vilosos foi facilitado (Figura 4A-J). O tecido recém-incluído exibiu uma matriz densamente povoada de microvilosidades em toda a sua superfície (Figura 4 A,B). Algumas regiões exibiram estruturas vesiformes. Em contraste, o tecido da cultura estática manifestou uma redução substancial das microvilosidades após 24 h (Figura 4C,D), uma redução que persistiu após 48 h (Figura 4E,F). Enquanto algumas áreas apresentavam agregação de estruturas vesiformes que não haviam sido liberadas, outras regiões pareciam nuas e erodidas (Figura 4D,F). Nos tecidos submetidos à cultura em fluxo, as microvilosidades ainda estavam presentes na superfície após 24 h (Figura 4G,H), bem como após 48 h (Figura 4I,J), embora em menor extensão do que no tecido fresco. Em comparação com a cultura estática, a prevalência de estruturas vesiculares na superfície foi reduzida. Curiosamente, essas estruturas vesículas estavam notavelmente concentradas em recessos específicos, onde o fluxo poderia estar reduzido ou ausente (Figura 4H,J), sugerindo que elas poderiam ter sido deslocadas da superfície do tecido exposto ao fluxo devido ao fluxo do meio3. Figura 1: Configuração do sistema de vazão. (A) O sistema de vazão montado, composto pelo reservatório e cinco câmaras de fluxo, é conectado a uma das bombas peristálticas. No lado direito há uma placa de seis poços na qual os explantes são cultivados estaticamente. (B,C) Para ambos os métodos de cultivo, as amostras placentárias são dissecadas em explantes vilosos de aproximadamente 0,5cm2, dos quais quatro explantes são usados por poço ou câmara. Em uma abordagem experimental, cinco câmaras ou poços são usados. (D,E) Para cultura de fluxo, uma placa de metal com elevações estreitas em forma de agulha é usada para fixar os explantes. (F,G) As aberturas dos tubos estão localizadas na cabeça das câmaras e, portanto, são usadas de cabeça para baixo para garantir que o tecido seja exposto ao fluxo direto. Esse dado é reproduzido de Kupper et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Análise morfológica dos explantes vilosos placentários em fluxo e cultura estática. (A-E) Coloração por imunofluorescência para β-actina para visualização do citoesqueleto de explantes em cultura. Para a análise, foram utilizados seis pontos por lâmina, selecionados aleatoriamente. Imagens representativas são mostradas. (A) Visualização do citoesqueleto do tecido embutido diretamente após o preparo. Barra de escala: 20 μm. (B-E) Representação representativa da degeneração dependente do tempo e do citoesqueleto da actina em explantes cultivados de fluxo e cultura estática. (C-E) Os asteriscos significam aumento do acúmulo de microfilamentos de actina, o que é uma indicação de degradação do citoesqueleto da actina. (F-J) Coloração hematoxilina-eosina de explantes vilosos. Barra de escala: 100 μm. (F,G) Explantes de tecido recém-embutido (F) e cultura em fluxo por 24 h (G) mostram uma morfologia bem preservada de um explante viloso. (I) Explantes cultivados em fluxo por 48 h mostram áreas intermitentemente destacadas do sinciciotrofoblasto (seta). (H,J) Deterioração tempo-dependente da integridade estrutural após cultura estática de explantes, indicada pelo deslocamento do sinciciotrofoblasto (seta) e estroma perfurado. (K-O) CD34 II foi usado para corar as células endoteliais vilosas. Barra de escala: 100 μm. (K,L) Tecido fresco (K) e explantes cultivados por 24 h em condições de fluxo (L) exibem um padrão característico de células endoteliais estruturalmente alinhadas. (N) Após 48 h em cultura de fluxo, a integridade vascular diminui até certo ponto. (M,O) Na cultura estática, vasos sanguíneos colapsados já são visíveis após 24 h (M), o que foi observado aumentar com o maior tempo de cultivo estático (O). Esse dado é reproduzido de Kupper et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Exame ultraestrutural pré e pós-cultivo de explantes vilosos utilizando microscopia eletrônica de transmissão. Tecido de três experimentos independentes foi utilizado para analisar as imagens. (A) Uma imagem representativa de tecido recém-incorporado mostra uma grande quantidade de microvilosidades (MV) na superfície do sinciciotrofoblasto (ST). Capilares estruturalmente intactos (Ca) são visíveis no estroma (S) bem preservado. (B) No tecido cultivado estaticamente por 24 h, há deterioração da integridade estrutural do sinciciotrofoblasto, que parece estar desconectado da membrana basal em algumas áreas. Há também um acúmulo perceptível de gotículas lipídicas (DL). (C) Após 48 h em cultura estática, observa-se grave deterioração ultra-estrutural. Tanto o estroma quanto o sinciciotrofoblasto são perfurados e um acúmulo maciço de gotículas lipídicas é evidente. Os vasos sanguíneos mal puderam ser rastreados. (D,E) A ultraestrutura do tecido da cultura em fluxo foi relativamente bem preservada após 24 h (D) e após 48 h (E). Barra de escala: 2 μm. MV: Microvilosidades, ST: Sinciciotrofoblasto, S: Estroma, Ca: Capilar, LD: Gotículas lipídicas. Esse dado é reproduzido de Kupper et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Exame ultraestrutural pré e pós-cultivo de explantes vilosos por microscopia eletrônica de varredura. (A,C,E,G,I) Imagens gerais da superfície das árvores vilosas placentárias com respectivas imagens detalhadas (B,D,F,H,J). (A,B) O tecido recém-incorporado exibe uma densa costura de microvilosidades. (B) Estruturas vesiculares podem ser notadas em alguns locais. (C-F) Após 24 h e 48 h em cultura estática, é visível uma diminuição das microvilosidades na superfície do sinciciotrofoblasto. Impressionante é o extenso acúmulo de partículas vesiculares na superfície do explante. (F) As partículas parecem murchar após 48 h em cultura estática. (G-J) A superfície do tecido da cultura em fluxo parece estar mais preservada após 24 h (G,H) e após 48 h (I,J) em comparação com a cultura estática. As microvilosidades são visíveis na superfície (H,J), embora não na mesma densidade elevada que no tecido fresco. (B) Partículas vesiculares podem ser vistas espalhadas nos nichos com fluxo reduzido. Esse dado é reproduzido de Kupper et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Tabela suplementar 1: Configurações experimentais para fluxo viloso placentário e cultura estática. Clique aqui para baixar este arquivo. Quadro Suplementar 2: Especificações do sistema de escoamento e estático. Clique aqui para baixar este arquivo. Tabela Suplementar 3: Anticorpos para imunoistoquímica e imunofluorescência utilizados neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.