Вот протокол культивирования плацентарных эксплантов в условиях постоянного потока. Этот подход улучшает традиционные статические системы культивирования ворсинок, позволяя воспроизводить динамические физиологические среды.
Существующие модели культивирования эксплантов плаценты ex vivo в основном основаны на статических культуральных системах с использованием планшетов. Однако эти модели неадекватно отражают динамику внутриутробного развития , когда плацента испытывает постоянное небольшое напряжение сдвига из-за плазмы или кровотока. Чтобы устранить это ограничение, была разработана система проточной культуры, которая приближает культивирование эксплантов плаценты ex vivo к условиям внутриутробного потока, наблюдаемым в материнском организме. В рамках этого подхода экспланты плаценты культивируются в последовательности из пяти взаимосвязанных проточных камер. Эта настройка поддерживает физиологическую концентрацию кислорода и постоянный расход. Собранные данные показывают, что в условиях потока сохранение морфологии тканей заметно улучшается по сравнению с традиционными статическими методами. Этот инновационный метод представляет собой простой способ эксплантации плацентарной культуры ex vivo, предлагая более точное представление динамики среды in vivo . Кроме того, данное исследование открывает новые возможности для изучения функциональной динамики фетоматеринского интерфейса. Использование осуществимых динамических методологий способствует более глубокому пониманию биологии плаценты, подчеркивая ее значимость для здоровья матери и плода.
С 1960-х годов для изучения фетоматеринского интерфейса 1,2,3 используется культивирование плацентарных эксплантов на дне лунки. Этот метод хорошо зарекомендовал себя и прост, позволяя использовать человеческие ткани для различных исследований, в дополнение к культурам одиночных клеток 2,3. С течением времени экспериментальные схемы для культур плацентарных эксплантов были модифицированы с учетом концентрации кислорода4 и предотвращения оседания тканина дне планшета 2,5,6. Однако этот метод не был адаптирован к условиям in vivo в матке, в частности, к наличиюпостоянного потока3.
Успех беременности зависит от адекватной и последовательной перфузии межворсинчатого пространства материнской кровью, установления динамического контура с непрерывным притоком и оттоком крови и веществ, передающихся через кровь 7,8,9,10,11,12. Плацента имеет две различные системы кровоснабжения, одну для материнской крови и одну для фетальной крови, что приводит к двойной перфузии как плодной, так и материнской системами13. Материнская кровь начинает перфузировать межворсинчатое пространство плаценты в конце первого триместра, медленно протекая по расширенным спиральным артериям матки10,11,14. Следовательно, плацентарные ворсинчатые деревья омываются материнской кровью, доставляя питательные вещества и кислород к плоду. Эта материнская кровь течет через межворсинчатое пространство, прежде чем вернуться в материнский кровоток через маточно-плацентарные вены. При его прохождении через межворсинчатое пространство диффузия и активное поглощение кислорода и питательных веществ в кровь плода приводят к снижению уровня кислорода и питательных веществ в крови матери12,15. Однако кровь межворсинчатого пространства полностью замещается свежей, богатой кислородом кровью примерно два-три раза в минуту, обеспечивая непрерывное поступление питательных веществ и газов13. Примечательно, что синцитиотрофобласт, самая внешняя часть плацентарного барьера, является единственным компонентом плацентарного ворсинчатого дерева, непосредственно контактирующего с материнской кровью15,16,17. Следовательно, синцитиотрофобласт испытывает постоянное слабое напряжение сдвига от протекающей материнской крови 3,14.
Современные научные знания о среде плацентарного оттока и современные технические достижения позволяют проводить адаптированное и физиологически приближенное культивирование плацентарных эксплантов в условиях потока. Кроме того, данные свидетельствуют о том, что сдвиговые силы влияют на биологические функции синцитиотрофобласта 18,19,20,21. Хорошо известным подходом, учитывающим кровоток, является плацентарная двухдолевая перфузионная система22. Однако эти эксперименты требуют значительных знаний, ограничены по времени (проводятся всего несколько часов) и возможны только с образцами плаценты третьего триместра 3,23. В отличие от этого, мы разработали простой и неинвазивный метод эксплантации ex vivo плацентарных ворсинчатых эксплантов при постоянных настройках потока, учитывающий ткани плаценты как в первом, так и в третьем триместре3. В этой установке экспланты плаценты культивируются в пяти последовательно соединенных проточных камерах. Ворсинчатые экспланты крепятся ко дну камеры с помощью игольчатых возвышений на тонких металлических пластинах. Построенный проточный контур затем переносится в биореактор, где регулируются как концентрация кислорода, так и расход3. Результаты проточной культуры показывают, что целостность тканей сохраняется лучше по сравнению с обычно используемым статическим методом3. Кроме того, этот динамический подход позволяет создавать новые и адаптированные экспериментальные проекты для культивирования эксплантов тканей, что позволяет проводить эксперименты in vitro, которые более точно имитируют естественную среду3.
В этом исследовании представлен уникальный взгляд на метод проточной культуры для эксплантов плаценты, предназначенный для воспроизведения динамики внутриутробной среды 3,23. Полученные результаты показывают, что морфология ткани, культивируемой в проточных условиях, лучше сохраняется по сравнению с традиционным статическим методом культивирования3. Примечательно, что, несмотря на то, что ни статические, ни проточные условия культивирования не способствуют перфузии плацентарных сосудов, разрушение фетоплацентарных кровеносных сосудов внутри ворсинчатой стромы наблюдалось преимущественно в статической культуре, в то время как целостность кровеносных сосудов, по-видимому, лучше сохранялась в течение более длительного времени в проточной культуре3.
Одно из возможных объяснений этого наблюдения может быть связано с решающей защитной и эндокринной ролью синцитиотрофобласта, функцией, хорошо задокументированной в литературе 12,24,25,26. Учитывая это, можно предположить, что общая целостность наружного слоя ворсинок в значительной степени способствует поддержанию нижележащей стромы, включая кровеносные сосуды. Следовательно, устойчивая клеточная целостность кровеносных сосудов в условиях потока может быть приписана непрерывному потоку среды. Это движение способствует пассивному движению эксплантов, облегчая обмен газами, питательными веществами и наночастицами (например, внеклеточными везикулами) через плацентарный барьер. Это, в свою очередь, может положительно повлиять на сохранение морфологии кровеносных сосудов. Кроме того, феномен механочувствительности играет роль в морфогенезе тканей в различных тканях27,28. Исследования показали, что механочувствительность влияет на клеточные процессы на нескольких уровнях, вызывая ряд биохимических реакций, которые в конечном итоге влияютна функциональность тканей и органов. Примечательно, что механочувствительные белки экспрессируются синцитиотрофобластом на протяжении всей гестации28. Кроме того, исследование предполагает, что микроворсинки на поверхности тканей могут быть вовлечены в этот контекст28.
Еще одна перспектива, которую стоит рассмотреть, — это потенциальная роль митохондрий в клеточном ответе на поток. Например, в эндотелиальных клетках митохондрии служат преобразователями сигналов клеточных реакций настимулы окружающей среды. Повышенное накопление липидных капель, наблюдаемое в статической культивируемой ткани через TEM3, было связано с индукцией апоптоза из-за митохондриальной дисфункции31. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы раскрыть основные механизмы и ключевые факторы, связывающие их с нисходящими сигнальными путями. Это исследование может улучшить наше понимание того, как ткань воспринимает и реагирует на напряжение сдвига, что приведет к улучшению жизнеспособности и целостности ворсинчатых эксплантов в культуре23.
Несколько критически важных шагов протокола должны быть повторены и выполнены с осторожностью. После плацентарных родов ткань должна быть культивирована как можно быстрее. Во время подготовки эксплантата очень важно избегать участков с видимыми инфарктами. Важно осторожно обращаться с эксплантами щипцами, чтобы предотвратить сдавливание. Рекомендуется держать ткани покрытыми жидкостью на протяжении всей процедуры и проводить ее быстро.
Важно отметить, что данное исследование не позволяет определить точное напряжение сдвига в представленной проточной системе, что следует рассматривать как ограничение в будущих исследованиях 3,23. Тем не менее, важно понимать, что точная скорость потока и напряжение сдвига для конкретного ворсинки плаценты in vivo зависят от множества параметров, таких как геометрические характеристики межворсинчатого пространства, расположение ворсинок в этом пространстве, а также его близость и угол к материнским спиральным артериям и маточным венам 3,19,23,32 . Необходимо также учитывать сложность геометрической структуры плаценты, которая варьируется у разных людей23,32. Уже существуют математические модели, оценивающие кровоток в межворсинчатом пространстве32 и расчеты напряжения сдвига стенки синцитиотрофобласта19,28. Интересно, что в одном исследовании предсказывалось, что напряжение сдвига синцитиотрофобласта ниже в третьем триместре по сравнению с первым триместром28, в то время как другое исследование продемонстрировало пространственно неоднородное напряжение сдвига стенки на синцитиотрофобласте19. Определение точной скорости потока и напряжения сдвига для конкретного ворсинки плаценты остается сложной задачей 3,19,23,32. Такие расчеты дают приблизительное представление о диапазоне напряжений сдвига для будущих исследований, но они могут потребовать постоянной анатомической корректировки и оптимизации23. Кроме того, в будущих исследованиях могут быть разработаны новые и усовершенствованные методы проточного культивирования, учитывающие сложную геометрию межворсинчатого пространства и стратегии увеличения количества образцов в эксперименте. Ожидается дальнейший прогресс и развитие проточной системы, в которой потенциально могут использоваться альтернативные проточные камеры (Brugger et al., неопубликованные данные, 2023 г.).
В заключение, это исследование закладывает прочную основу, демонстрируя легко реализуемую технику проточной культуры ex vivo, которая поддерживает структурную целостность культивируемых ворсинчатых эксплантов. Это подчеркивает важность динамических методов в исследованиях функциональной биологии плаценты, прокладывая путь к дальнейшему развитию систем проточных культур и генерации новых идей и гипотез 3,23.
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают признательность Беттине Амтманн и Петре Винклер за отличную техническую поддержку при взятии образцов тканей. Это исследование финансировалось Австрийским научным фондом FWF (DOC 31-B26) и Медицинским университетом Граца, Австрия, в рамках программы PhD «Воспалительные заболевания во время беременности» (DP-iDP).
6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
Metal plate with needles | In-house construction | ||
Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |