إكس فيفو ثقافة تدفق زرع المشيمة - محاكاة الظروف الديناميكية في الرحم
Summary
فيما يلي بروتوكول لزراعة نباتات المشيمة في ظل ظروف التدفق المستمر. يعزز هذا النهج أنظمة الاستزراع الزغبي الثابتة التقليدية من خلال تمكين تكرار البيئات الفسيولوجية الديناميكية.
Abstract
ترتكز نماذج زراعة المشيمة خارج الجسم الحي بشكل أساسي على أنظمة الاستزراع الساكن باستخدام ألواح الآبار. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج لا تعكس بشكل كاف الديناميكية في وضع الرحم ، حيث تواجه المشيمة إجهاد قص طفيف ثابت بسبب البلازما أو تدفق الدم. لمعالجة هذا القيد ، تم تصميم نظام زراعة التدفق لتقريب زراعة زراعة المشيمة خارج الجسم الحي من ظروف التدفق في الرحم التي تحدث داخل جسم الأم. ضمن هذا النهج ، تزرع نباتات المشيمة في سلسلة من خمس غرف تدفق مترابطة. يحافظ هذا الإعداد على تركيزات الأكسجين الفسيولوجي ومعدل تدفق ثابت. تكشف البيانات التي تم جمعها أنه في ظل ظروف التدفق ، يظهر الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة تحسنا ملحوظا مقارنة بالطرق الثابتة التقليدية. تقدم هذه التقنية المبتكرة وسيلة مباشرة لثقافة زرع المشيمة خارج الجسم الحي ، مما يوفر تمثيلا أكثر إخلاصا للديناميكية في بيئة الجسم الحي . علاوة على ذلك ، تقدم هذه الدراسة إمكانيات جديدة للتحقيق في الديناميات الوظيفية لواجهة الجنين والأم. من خلال تبني منهجيات ديناميكية مجدية ، يتم تسهيل فهم أعمق لبيولوجيا المشيمة ، مما يؤكد أهميتها لصحة الأم والجنين.
Introduction
منذ ستينيات القرن العشرين ، تم استخدام زراعة المشيمة في الجزء السفلي من صفيحة البئر لدراسة واجهة الجنين والأم1،2،3. هذه الطريقة راسخة ومباشرة ، مما يتيح استخدام الأنسجة البشرية لدراسات مختلفة ، بالإضافة إلى مزارع الخلايا المفردة 2,3. بمرور الوقت ، تم تعديل التصاميم التجريبية لمزارع زرع المشيمة فيما يتعلق بتركيز الأكسجين4 ولمنع الأنسجة من الاستقرار في قاع صفيحة البئر2،5،6. ومع ذلك ، لم يتم تكييف هذه الطريقة مع الظروف في الجسم الحي داخل الرحم ، وتحديدا وجود تدفق مستمر3.
يتوقف نجاح الحمل على التروية الكافية والمتسقة للفضاء بين الزغابات بدم الأم ، مما يؤدي إلى إنشاء دائرة ديناميكية مع تدفق مستمر للدم والمواد المنقولة بالدم7،8،9،10،11،12. تتميز المشيمة بنظامين متميزين لإمداد الدم ، أحدهما لدم الأم والآخر لدم الجنين ، مما يؤدي إلى نضح مزدوج من قبل كل من جهازي الجنين والأم13. يبدأ دم الأم في اختراق الفضاء بين الزغابات في المشيمة في نهاية الأشهر الثلاثة الأولى ، ويتدفق ببطء عبر الشرايين الحلزونية الرحمية الموسعة10،11،14. وبالتالي ، فإن الأشجار الزغبية المشيمة تغمر في دم الأم ، مما يوفر العناصر الغذائية والأكسجين للجنين. يتدفق دم الأم هذا عبر الفضاء بين الزغابات قبل أن يعود إلى الدورة الدموية للأم عبر الأوردة الرحمية. أثناء مروره عبر الفضاء بين الزغابات ، يؤدي الانتشار والامتصاص النشط للأكسجين والمواد المغذية في دم الجنين إلى انخفاض مستويات الأكسجين والمغذيات في دم الأم12,15. ومع ذلك ، يتم استبدال دم الفضاء بين الزغابات بالكامل بدم جديد غني بالأكسجين حوالي مرتين إلى ثلاث مرات في الدقيقة ، مما يضمن إمدادا مستمرا بالمغذيات والغازات13. والجدير بالذكر أن الأرومة المخلوية ، وهي الجزء الخارجي من حاجز المشيمة ، هي المكون الوحيد لشجرة الزغابات المشيمة المعرضة مباشرة لدم الأم15،16،17. وبالتالي ، فإن الأرومة المخلوية الغاذية تعاني من إجهاد قص خفيف ثابت من دم الأمالمتدفق 3,14.
تسمح المعرفة العلمية الحالية المتعلقة ببيئة تدفق المشيمة والتطورات التقنية الحديثة الآن بزراعة نباتات المشيمة المكيفة والتقريبية من الناحية الفسيولوجية في ظل ظروف التدفق. علاوة على ذلك ، تشير الأدلة إلى أن قوى القص تؤثر على الوظائف البيولوجية للأرومة المخلوية18،19،20،21. النهج المعروف الذي يفسر تدفق الدم هو نظام نضح المشيمة المزدوجالفص 22. ومع ذلك ، تتطلب هذه التجارب خبرة كبيرة ، وهي مقيدة بالوقت (يتم إجراؤها لبضع ساعات فقط) ، وهي ممكنة فقط مع عينات المشيمة في الثلث الثالث من الحمل3،23. في المقابل ، قمنا بتطوير تقنية مباشرة وغير تدخلية لزراعة الزغابات المشيمية خارج الجسم الحي تحت إعدادات التدفق المستمر ، لاستيعاب كل من أنسجة المشيمة في الثلث الأول والثالثمن الحمل 3. في هذا الإعداد ، تزرع نباتات المشيمة في خمس غرف تدفق متصلة بالسلسلة. يتم تثبيت النباتات الزغبية في قاع الغرفة باستخدام ارتفاعات على شكل إبرة على ألواح معدنية رقيقة. يتم نقل دائرة التدفق المبنية لاحقا إلى مفاعل حيوي ، حيث يتم تنظيم كل من تركيز الأكسجين ومعدل التدفق3. تظهر نتائج زراعة التدفق أنه يتم الحفاظ على سلامة الأنسجة بشكل أفضل مقارنة بالطريقة الثابتةالمستخدمة عادة 3. علاوة على ذلك ، يتيح هذا النهج الديناميكي تصميمات تجريبية جديدة ومكيفة لزراعة الأنسجة ، مما يسمح بإجراء تجارب في المختبر تحاكي البيئة الطبيعية بشكل أوثق3.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الدراسة منظورا فريدا حول تقنية زراعة التدفق لنباتات المشيمة المصممة لتكرار الديناميكية في بيئة الرحم 3،23. تكشف النتائج أن مورفولوجيا الأنسجة المزروعة في ظل ظروف التدفق يتم الحفاظ عليها بشكل أفضل مقارنة بطريقة الزراعة الثابتة التقليدية3. والجدير بالذكر أنه على الرغم من أن ظروف الاستزراع الساكن أو التدفق لا تسهل تروية الأوعية المشيمية ، فقد لوحظ في الغالب تدمير الأوعية الدموية الجنينية المشيمية داخل السدى الزغبي في الثقافة الساكنة ، في حين بدا أن سلامة الأوعية الدموية يتم الحفاظ عليها بشكل أفضل على مدى فترة أطول في ثقافة التدفق3.
يمكن ربط أحد التفسيرات المحتملة لهذه الملاحظة بالدور الوقائي الحاسم والغدد الصماء للأرومة المخلوية ، وهي وظيفة موثقة جيدا في الأدبيات12،24،25،26. بالنظر إلى ذلك ، من المتصور أن السلامة العامة للطبقة الخارجية من الزغابات تساهم بشكل كبير في الحفاظ على السدى الأساسي ، بما في ذلك الأوعية الدموية. وبالتالي ، يمكن أن تعزى السلامة الخلوية المستمرة للأوعية الدموية في ظل ظروف التدفق إلى التدفق المستمر للوسط. تساعد هذه الحركة في الحركة السلبية للنباتات ، مما يسهل تبادل الغازات والمغذيات والجسيمات النانوية (مثل الحويصلات خارج الخلية) عبر حاجز المشيمة. وهذا بدوره يمكن أن يؤثر بشكل إيجابي على الحفاظ على مورفولوجيا الأوعية الدموية. علاوة على ذلك ، تلعب ظاهرة الإحساس الميكانيكي دورا في تكوين الأنسجة عبر الأنسجةالمختلفة 27,28. أظهرت الدراسات أن الحساسية الميكانيكية تؤثر على العمليات الخلوية على مستويات متعددة ، مما يؤدي إلى مجموعة من الاستجابات الكيميائية الحيوية التي تؤثر في النهاية على وظائف الأنسجةوالأعضاء 29. والجدير بالذكر أن البروتينات الحساسة للميكانيكا يتم التعبير عنها بواسطة الأرومة المخلوية طوال فترة الحمل28. علاوة على ذلك ، تشير الدراسة إلى أن الزغابات الدقيقة على سطح الأنسجة قد تكون متورطة في هذا السياق28.
هناك منظور إضافي يستحق النظر وهو الدور المحتمل للميتوكوندريا في الاستجابة الخلوية للتدفق. على سبيل المثال ، في الخلايا البطانية ، تعمل الميتوكوندريا كمحولات إشارة للاستجابات الخلوية للمنبهات البيئية30. ارتبطت زيادة تراكم قطرات الدهون ، التي لوحظت في الأنسجة المستزرعة الثابتة من خلال TEM3 ، بتحريض موت الخلايا المبرمج بسبب خلل الميتوكوندريا31. ومن الضروري إجراء مزيد من التحقيقات للكشف عن الآليات الأساسية والعوامل الرئيسية، وربطها بمسارات الإشارات النهائية. يمكن أن يعزز هذا الاستكشاف فهمنا لكيفية إدراك الأنسجة لإجهاد القص وتفاعله معه ، مما يترجم إلى تحسين صلاحية وسلامة النباتات الزغبية في الثقافة23.
يجب تكرار العديد من خطوات البروتوكول الحاسمة وتنفيذها بعناية. بعد ولادة المشيمة ، يجب زراعة الأنسجة في أسرع وقت ممكن. أثناء تحضير الزرع ، يعد تجنب المناطق ذات الاحتشاء المرئي أمرا بالغ الأهمية. من المهم التعامل بلطف مع النباتات باستخدام الملقط لمنع الضغط. يوصى بإبقاء الأنسجة مغطاة بالسائل طوال العملية وإجرائها بسرعة.
من المهم الاعتراف بأن هذه الدراسة غير قادرة على تحديد إجهاد القص الدقيق داخل نظام التدفق المقدم ، والذي يجب اعتباره قيدا في التحقيقات المستقبلية 3,23. ومع ذلك ، من المهم إدراك أن سرعة التدفق الدقيقة وإجهاد القص لزغابات مشيمية معينة في الجسم الحي تتأثر بالعديد من المعلمات ، مثل الخصائص الهندسية للفضاء بين الزغابات ، وموقع الزغابات داخل هذا الفضاء ، وقربها وزاويتها من الشرايين الحلزونية الأم والأوردة الرحمية3،19،23،32. يجب أن يؤخذ تعقيد البنية الهندسية للمشيمة ، والتي تختلف بين الأفراد ، في الاعتبار أيضا23,32. توجد بالفعل نماذج رياضية تقدر تدفق الدم داخل الفضاء بين الزغابات32 والحسابات على إجهاد قص الجدار على الأرومة المخلوية19,28. ومن المثير للاهتمام ، أن إحدى الدراسات تنبأت بأن إجهاد القص على الأرومة المخلوية يكون أقل في الثلث الثالث من الحمل مقارنة بالثلث الأول من الحمل28 ، بينما أظهرت دراسة أخرى إجهاد قص الجدار غير المتجانس مكانيا على الأرومة المخلوية19. لا يزال تحديد سرعة التدفق الدقيقة وإجهاد القص لزغابات مشيمية معينة يمثل تحديا3،19،23،32. تقدم هذه الحسابات تقديرا تقريبيا لنطاق إجهاد القص للتحقيقات المستقبلية ، ولكنها قد تتطلب تعديلات تشريحية مستمرة وتحسينا23. علاوة على ذلك ، قد تطور الدراسات المستقبلية تقنيات جديدة ومحسنة لثقافة التدفق التي تأخذ في الاعتبار الهندسة المعقدة للفضاء بين الزغابات واستراتيجيات لزيادة عدد العينات لكل تجربة3. من المتوقع حدوث تقدم وتطوير مستمرين لنظام التدفق ، مما قد يؤدي إلى استخدام غرف تدفق بديلة (Brugger et al. ، بيانات غير منشورة ، 2023).
في الختام ، تضع هذه الدراسة أساسا قويا من خلال إظهار تقنية استزراع التدفق خارج الجسم الحي القابلة للتنفيذ بسهولة والتي تدعم السلامة الهيكلية للنباتات الزغبية المستزرعة. إنه يؤكد على أهمية التقنيات الديناميكية في دراسات البيولوجيا الوظيفية للمشيمة ، مما يمهد الطريق لمزيد من التقدم في أنظمة ثقافة التدفق وتوليد أفكار وفرضيات جديدة3،23.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقدر المؤلفون بامتنان الدعم الفني الممتاز الذي قدمته بيتينا أمتمان وبيترا وينكلر لأخذ عينات الأنسجة. تم تمويل هذا البحث من قبل صندوق العلوم النمساوي FWF (DOC 31-B26) وجامعة غراتس الطبية ، النمسا ، من خلال برنامج الدكتوراه الاضطرابات الالتهابية في الحمل (DP-iDP).
Materials
| 6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
| Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
| antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
| anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
| Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
| CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
| CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
| Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
| Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
| Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
| Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
| Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
| Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
| Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
| Metal plate with needles | In-house construction | ||
| Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
| Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
| Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
| Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
| QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
| SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
| Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
| Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
| TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
| UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
| UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
| Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |
References
- Villee, C. A. The metabolism of human placenta in vitro. Journal of Biological Chemistry. 205 (1), 113-123 (1953).
- Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: Approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
- Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. Placental villous explant culture 2.0: flow culture allows studies closer to the in vivo situation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7464 (2021).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell and Tissue Research. 328 (3), 607-616 (2007).
- Simán, C. M., Sibley, C. P., Jones, C. J. P., Turner, M. A., Greenwood, S. L. The functional regeneration of syncytiotrophoblast in cultured explants of term placenta. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 280 (4), R1116-R1122 (2001).
- Toro, A. R., et al. Leptin is an anti-apoptotic effector in placental cells involving p53 downregulation. PLoS ONE. 9 (6), e99187 (2014).
- Morley, L. C., Debant, M., Walker, J. J., Beech, D. J., Simpson, N. A. B. Placental blood flow sensing and regulation in fetal growth restriction. Placenta. 113, 23-28 (2021).
- Wang, Y. Z. S., Wang, Y., Zhao, S. Placental blood circulation. Vascular biology of the placenta. Chapter 2, (2010).
- Huppertz, B. The anatomy of the normal placenta. Journal of Clinical Pathology. 61 (12), 1296-1302 (2008).
- Weiss, G., Sundl, M., Glasner, A., Huppertz, B., Moser, G. The trophoblast plug during early pregnancy: a deeper insight. Histochemistry and Cell Biology. 146 (6), 749-756 (2016).
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. P. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Gude, N. M., Roberts, C. T., Kalionis, B., King, R. G. Growth and function of the normal human placenta. Thrombosis Research. 114 (5-6), 397-407 (2004).
- Wang, Y. Vascular biology of the placenta. Colloquium Series on Integrated Systems Physiology: From Molecule to Function. 2 (1), 1-98 (2010).
- Moser, G., Windsperger, K., Pollheimer, J., de Sousa Lopes, S. C., Huppertz, B. Human trophoblast invasion: new and unexpected routes and functions. Histochemistry and Cell Biology. 150 (4), 361-370 (2018).
- Kupper, N., Huppertz, B. The endogenous exposome of the pregnant mother: Placental extracellular vesicles and their effect on the maternal system. Molecular Aspects of Medicine. 87 (October 2020), 100955 (2022).
- Huppertz, B. IFPA award in placentology lecture: biology of the placental syncytiotrophoblast – myths and facts. Placenta. 31 (SUPPL), S75-S81 (2010).
- Gauster, M., Moser, G., Wernitznig, S., Kupper, N., Huppertz, B. Early human trophoblast development: from morphology to function. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (6), 345 (2022).
- Lecarpentier, E., et al. Fluid shear stress promotes placental growth factor upregulation in human syncytiotrophoblast through the cAMP-pKA signaling pathway. Hypertension. 68 (6), 1438-1446 (2016).
- Lecarpentier, E., et al. Computational fluid dynamic simulations of maternal circulation: wall shear stress in the human placenta and its biological implications. PLOS ONE. 11 (1), e0147262 (2016).
- Miura, S., Sato, K., Kato-Negishi, M., Teshima, T., Takeuchi, S. Fluid shear triggers microvilli formation via mechanosensitive activation of TRPV6. Nature Communications. 6 (1), 8871 (2015).
- Jauniaux, E., et al. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress. The American Journal of Pathology. 157 (6), 2111-2122 (2000).
- Sodha, R. J., Proegler, M., Schneider, H. Transfer and metabolism of norepinephrine studied from maternal-to-fetal and fetal-to-maternal sides in the in vitro perfused human placental lobe. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 148 (4), 474-481 (1984).
- Kupper, N. . Extracellular vesicles from advanced placental explant flow culture and their role in preeclampsia [Dissertation]. , (2022).
- Burton, G. J., Fowden, A. L. The placenta: a multifaceted, transient organ. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1663), 20140066 (2015).
- Arora, N., Sadovsky, Y., Dermody, T. S., Coyne, C. B. Microbial vertical transmission during human pregnancy. Cell Host & Microbe. 21 (5), 561-567 (2017).
- Cheong, M. L., et al. A Positive feedback loop between glial cells missing 1 and human chorionic gonadotropin (hCG) regulates placental hCGβ expression and cell differentiation. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 197-209 (2016).
- Heisenberg, C. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Lee, T. C., Moulvi, A., James, J. L., Clark, A. R. Multi-scale modelling of shear stress on the syncytiotrophoblast: could maternal blood flow impact placental function across gestation. Annals of Biomedical Engineering. 51 (6), 1256-1269 (2023).
- Kluge, M. A., Fetterman, J. L., Vita, J. A. Mitochondria and endothelial function. Circulation Research. 112 (8), 1171-1188 (2013).
- Boren, J., Brindle, K. M. Apoptosis-induced mitochondrial dysfunction causes cytoplasmic lipid droplet formation. Cell Death & Differentiation. 19 (9), 1561-1570 (2012).
- Chernyavsky, I. L., Jensen, O. E., Leach, L. A Mathematical model of intervillous blood flow in the human placentone. Placenta. 31 (1), 44-52 (2010).
