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Developmental Biology

Ex Vivo Coltura a flusso di espianto placentare - Imitazione delle condizioni dinamiche in utero

Published: September 08, 2023
doi:
10.3791/65919
, , , ,
1Division of Cell Biology, Histology and Embryology, Gottfried Schatz Research Center,Medical University of Graz

Summary

Ecco un protocollo per la coltura di espianti placentari in condizioni di flusso costante. Questo approccio migliora i tradizionali sistemi di coltura statica dei villi consentendo la replicazione di ambienti fisiologici dinamici.

Abstract

I modelli di coltura di espianto placentare ex vivo esistenti sono principalmente basati su sistemi di coltura statici che utilizzano piastre a pozzetti. Tuttavia, questi modelli riflettono in modo inadeguato la dinamica in utero, in cui la placenta incontra un leggero stress di taglio costante dovuto al plasma o al flusso sanguigno. Per ovviare a questa limitazione, è stato ideato un sistema di coltura a flusso per avvicinare la coltivazione ex vivo dell’espianto placentare alle condizioni di flusso in utero sperimentate all’interno del corpo materno. Nell’ambito di questo approccio, gli espianti placentari vengono coltivati in una sequenza di cinque camere di flusso interconnesse. Questa impostazione mantiene le concentrazioni fisiologiche di ossigeno e una portata costante. I dati raccolti rivelano che, in condizioni di flusso, la conservazione della morfologia tissutale mostra un notevole miglioramento rispetto ai metodi statici convenzionali. Questa tecnica innovativa introduce un metodo semplice di coltura ex vivo dell’espianto placentare, offrendo una rappresentazione più fedele dell’ambiente dinamico in vivo . Inoltre, questo studio introduce nuove possibilità per studiare le dinamiche funzionali dell’interfaccia feto-materna. Abbracciando metodologie dinamiche fattibili, viene facilitata una comprensione più profonda della biologia placentare, sottolineandone l’importanza per la salute materno-fetale.

Introduction

A partire dagli anni ’60, la coltivazione dell’espianto placentare sul fondo di una piastra a pozzetti è stata utilizzata per studiare l’interfaccia feto-materna 1,2,3. Questo metodo è ben consolidato e semplice, consentendo l’utilizzo di tessuto umano per vari studi, oltre a colture di singole cellule 2,3. Nel corso del tempo, i disegni sperimentali per le colture di espianto placentare sono stati modificati per quanto riguarda la concentrazione di ossigeno4 e per evitare che il tessuto si depositi sul fondo della piastra 2,5,6. Tuttavia, questo metodo non è stato adattato alle condizioni in vivo all’interno dell’utero, in particolare alla presenza di un flusso costante3.

Il successo di una gravidanza dipende da un’adeguata e costante perfusione dello spazio intervilloso con il sangue materno, stabilendo un circuito dinamico con continuo afflusso e deflusso di sangue e sostanze ematiche 7,8,9,10,11,12. La placenta presenta due distinti sistemi di afflusso di sangue, uno per il sangue materno e uno per il sangue fetale, con conseguente doppia perfusione da parte di entrambi i sistemi fetale e materno13. Il sangue materno inizia a perfondere lo spazio intervilloso della placenta alla fine del primo trimestre, scorrendo lentamente attraverso le arterie a spirale uterina allargate10,11,14. Di conseguenza, gli alberi villosi placentari vengono immersi nel sangue materno, fornendo sostanze nutritive e ossigeno al feto. Questo sangue materno scorre attraverso lo spazio intervilloso prima di tornare alla circolazione materna attraverso le vene uteroplacentare. Durante il suo passaggio attraverso lo spazio intervilloso, la diffusione e l’assorbimento attivo di ossigeno e sostanze nutritive nel sangue fetale portano a livelli più bassi di ossigeno e nutrienti nel sangue materno12,15. Tuttavia, il sangue dello spazio intervilloso è interamente sostituito da sangue fresco e ricco di ossigeno circa due o tre volte al minuto, garantendo un apporto continuo di nutrienti e gas13. In particolare, il sinciziotrofoblasto, la parte più esterna della barriera placentare, è l’unico componente dell’albero dei villi placentari direttamente esposto al sangue materno15,16,17. Di conseguenza, il sinciziotrofoblasto subisce un costante lieve sforzo di taglio da parte del sangue maternoche scorre 3,14.

Le attuali conoscenze scientifiche relative all’ambiente di flusso placentare e i moderni progressi tecnici consentono ora una coltivazione adattata e fisiologicamente approssimata di espianti placentari in condizioni di flusso. Inoltre, l’evidenza suggerisce che le forze di taglio influenzano le funzioni biologiche del sinciziotrofoblasto 18,19,20,21. Un approccio ben noto che tiene conto del flusso sanguigno è il sistema di perfusione placentare a doppio lobo22. Tuttavia, questi esperimenti richiedono una notevole esperienza, sono limitati nel tempo (condotti solo per poche ore) e sono fattibili solo con campioni placentari del terzo trimestre 3,23. Al contrario, abbiamo sviluppato una tecnica semplice e non intrusiva per la coltura ex vivo dei villi placentari in condizioni di flusso costante, adattandosi sia ai tessuti placentari del primo che del terzo trimestre3. In questa configurazione, gli espianti placentari vengono coltivati in cinque camere di flusso collegate in serie. Gli espianti villi sono fissati al fondo della camera mediante rilievi aghiformi su sottili piastre metalliche. Il circuito di flusso costruito viene successivamente trasferito in un bioreattore, dove vengono regolate sia la concentrazione di ossigeno che la portata3. I risultati della coltura a flusso dimostrano che l’integrità dei tessuti è meglio preservata rispetto al metodo statico3 tipicamente utilizzato. Inoltre, questo approccio dinamico consente disegni sperimentali nuovi e adattati per la coltura di espianto di tessuti, consentendo esperimenti in vitro che imitano più da vicino l’ambiente naturale3.

Protocol

Il comitato etico dell’Università di Medicina di Graz ha approvato questo studio (31-019 ex 18/19 versione 1.2 e 29-319 ex 16/17). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti nello studio. 1. Preparazione per l’esperimento di flusso NOTA: Gli esperimenti sono condotti in un bioreattore con pompe peristaltiche integrate (vedi Tabella dei Materiali). L’umidità, la temperatura e il livello di gas all’interno del bioreattore possono essere regolati. Accendere il bioreattore e fare tutti i preparativi (ad esempio, calibrazione delle pompe, preriscaldamento, condizioni del gas e umidità) per l’esperimento secondo il manuale del bioreattore. Prima di iniziare l’esperimento, le impostazioni richieste (temperatura, contenuto di gas, umidità) devono essere stabilizzate per alcune ore o durante la notte. A tale scopo, avviare il bioreattore e il software, quindi fare clic su Modifica setpoint alla voce di menu “Incubatore”. Preriscaldare il PBS e il terreno richiesto (terreno di crescita delle cellule endoteliali integrato con gli integratori forniti hEGF-5, HC-500 e il 5% di siero fetale bovino impoverito di esosomi, l’1% di penicillina/streptomicina) (vedere la tabella dei materiali) a 37 °C.​ 2. Dissezione del campione placentare Immediatamente dopo il parto, tagliare tre volte 2 cm 3 campioni placentari dalla regione placentare media come descritto in Kupper etal.3 In breve, conservare i campioni in PBS. Scartare la placca coriale, la decidua materna e le aree di infarti visibili dal campione. Sezionare il campione di tessuto rimanente in espianti villosi con un diametro della sezione trasversale di circa 0,5 cm (peso umido di circa 7,5 mg). Trasferiscili in una capsula di Petri con PBS fresco. Lavare gli espianti in PBS scuotendoli delicatamente nel liquido con una pinzetta per rimuovere i residui di sangue.NOTA: Sezionare i campioni in una capsula di Petri con PBS per prelavarli ed evitare che si secchino e utilizzare strumenti sterilizzati/sterilizzati in autoclave per la lavorazione del tessuto. 3. Esperimento di flusso Sotto una cappa sterile, collegare cinque camere in serie al flacone del serbatoio utilizzando i luer lock secondo il manuale utente delle camere di flusso (vedere la tabella dei materiali).NOTA: Sterilizzare e/o sterilizzare in autoclave tutti i materiali prima dell’uso, secondo il rispettivo manuale. Utilizzare un filtro dell’aria sulla bombola del serbatoio per lo scambio di gas sterile. Per aprire e chiudere le camere, premere delicatamente le alette delle camere. Passaggio 3.1. può anche essere preparato prima. Capovolgere le camere e aprirle rimuovendo il fondo. Utilizzare una pinza per trasferire le piastre metalliche centralmente nella parte superiore delle camere con i perni rivolti verso l’alto. Riempire le camere con 1 mL di terreno preriscaldato (37 °C). Quindi riempire il serbatoio con altri 20 ml. Il circuito richiede un totale di 25 ml, compreso il volume in ciascuna camera di flusso, nei tubi e nella bottiglia del serbatoio. Sotto il flusso, il volume finale del mezzo in una camera piena è di 2 mL. Usa una pinza e trasferisci un espianto di villi dopo l’altro tra gli aghi della placca metallica nella camera. Lasciare che gli aghi scivolino tra i villi placentari per evitare la puntura del tessuto. Trasferire quattro espianti in una camera. Chiudere le camere rimontando con cura il fondo. Un circuito completo contiene un totale di 20 espianti. Le camere devono rimanere in posizione capovolta.NOTA: Afferrare delicatamente gli espianti con la pinza; Cerca di non schiacciarli. Assicurarsi che le camere e il circuito siano completamente sigillati per evitare perdite. Le camere vengono sempre utilizzate capovolte. Il numero di espianti per camera e il numero di camere stesse sono variabili. La procedura per il tessuto del primo trimestre è simile a quella per il tessuto del terzo trimestre con una piccola aggiunta: per fissare i villi, piegare leggermente gli aghi sugli espianti dopo che il tessuto è stato trasferito sulla placca metallica (comunicazione personale Brugger et al.). In questo modo si fissa il tessuto fragile sulla piastra metallica e si evita che i campioni scivolino via. Trasferire il gruppo di flusso nel bioreattore. Collegare il circuito di flusso alla pompa peristaltica all’interno del bioreattore collegando il tubo della pompa alla pompa. Fissalo sul 4° stage (si sentirà scattare quattro volte). Se è necessario un controllo statico, posizionare anche la piastra del pozzetto nel bioreattore.NOTA: Per la coltura statica, cinque pozzetti di una piastra a sei pozzetti vengono riempiti con 4 mL di terreno per pozzetto e 4 espianti villosi per pozzetto. Anche la piastra a pozzetti riempita viene posta nel bioreattore e coltivata nella stessa atmosfera degli espianti della coltura a flusso. Ulteriori dettagli sono descritti in Kupper et al.3 Impostare la modalità pompa su Manuale alla voce di menu “Pompe”. Quindi impostare la velocità della pompa su 1 mL/min e iniziare a pompare il fluido nel tubo facendo clic su Esegui. Mentre il circuito viene riempito di fluido, tenere le camere inclinate in modo che siano completamente riempite di fluido.NOTA: Vedere la Tabella supplementare 1 per le impostazioni sperimentali per il flusso dei villi placentari e la coltura statica. Le specifiche del sistema di flusso e statico sono fornite nella tabella supplementare 2.ATTENZIONE: Inclinare con cautela la camera durante il riempimento per evitare che i campioni scivolino via dagli aghi. Al termine del riempimento, le camere rimangono nella loro posizione capovolta. Assicurarsi che le camere siano in posizione fissa e verticale e chiudere entrambi i coperchi del bioreattore.NOTA: Il volume finale del fluido in una camera di flusso piena è di 2 ml. Le impostazioni sperimentali e le specifiche delle camere di flusso e delle piastre a pozzetti utilizzate negli esperimenti sono descritte in Kupper et al.3 Incubare il tessuto per il tempo desiderato.NOTA: La temperatura, il livello del gas e la portata possono essere monitorati sul computer senza aprire nuovamente il coperchio del bioreattore. Arrestare la pompa dopo l’incubazione del tessuto per il tempo desiderato facendo clic su Interrompi alla voce di menu “Pompe”. Aprire i due coperchi del bioreattore e poi una camera di flusso alla volta. Rimuovere con cautela gli espianti dalla piastra metallica utilizzando una pinza. Processare il tessuto e il surnatante in base all’analisi a valle selezionata. In questo caso, sono state eseguite la colorazione immunoistochimica e la microscopia elettronica3. Vedere la Tabella supplementare 3 per i dettagli degli anticorpi utilizzati per l’immunoistochimica e l’immunofluorescenza.NOTA: Dopo aver rimosso il tessuto, scaricare il fluido dal circuito ruotando la pompa in senso antiorario. Smontare e pulire il circuito di flusso secondo le istruzioni del produttore per le camere di flusso e i tubi.

Representative Results

Parti di questa pubblicazione e i suoi risultati sono già stati pubblicati (cfr. riferimenti 3 e 23). Configurazione sperimentaleUna configurazione sperimentale è illustrata nella Figura 1. Un ciclo di flusso composito comprende cinque camere di flusso interconnesse in serie (Figura 1A). All’interno di ogni camera di flusso vengono coltivati quattro espianti, ciascuno con un diametro della sezione trasversale di circa 0,5 cm (Figura 1 A,C). Per l’esperimento di controllo statico, gli espianti vengono coltivati in singoli pozzetti di una piastra a sei pozzetti (Figura 1B). Per evitare che gli espianti vengano lavati, vengono fissati su piastre metalliche caratterizzate da strette sporgenze aghiformi (Figura 1 D,E). Al fine di sottoporre gli espianti ad un flusso diretto del fluido, le camere sono invertite, con gli ingressi e le uscite posizionati nella sezione di testa (Figura 1 F,G). All’interno del bioreattore, il ciclo di flusso è collegato a una pompa peristaltica. Allo scopo di confrontare l’integrità tissutale tra il tessuto in coltura a flusso e il tessuto in coltura statica convenzionale, gli espianti vengono posti in una piastra a sei pozzetti adiacente al ciclo di flusso. Ciò garantisce la verifica di condizioni di coltura coerenti in termini di ossigeno, temperatura e umidità (Figura 1A)3. Analisi morfologica β-actinaSono state condotte varie procedure di colorazione immunoistochimica per esaminare le distinzioni istologiche nell’integrità dei tessuti associate a diverse condizioni di coltivazione (Figura 2). Gli espianti che sono stati prontamente incorporati dopo la dissezione sono serviti come riferimento di base. Per l’analisi del citoscheletro di actina all’interno degli espianti villosi, è stata eseguita la colorazione con β-actina (Figura 2A-E). L’analisi descrittiva ha svelato una presentazione visiva ben strutturata e organizzata del citoscheletro nel tessuto appena ottenuto (Figura 2A). Nel corso del tempo, con il progredire della coltivazione, si è osservata un’aggregazione di microfilamenti, a significare una degradazione della struttura del citoscheletro. Questo fenomeno è stato osservato in modo consistente negli espianti di villi sottoposti a coltivazione statica3 (Figura 2C,E, indicata da asterischi). Colorazione H&ELa colorazione H&E ha fornito un ulteriore rinforzo all’osservazione che l’integrità dei tessuti diminuisce nel corso della coltura statica, una tendenza che è migliorata nel contesto della coltura a flusso (Figura 2F-J). Il tessuto fresco ha mostrato una presentazione istologica strutturata e caratteristica degli espianti villosi, caratterizzata da uno stroma denso e compattamente impacchettato (Figura 2F). Inoltre, il sinciziotrofoblasto era saldamente aderente allo stroma sottostante (Figura 2F). Un aspetto comparabile è stato osservato negli espianti villosi coltivati in un ambiente di flusso per 24 ore (Figura 2G). Tuttavia, dopo 48 ore di coltivazione sotto flusso, sono state osservate porzioni del sinciziotrofoblasto parzialmente staccate (Figura 2I, indicate dalla freccia), accompagnate da sporadiche piccole lacune all’interno dello stroma. L’esame istologico del tessuto ha indicato che l’integrità del tessuto dopo 24 ore in una condizione di coltura statica non era adeguatamente conservata (Figura 2H). Inoltre, questa integrità si è ulteriormente degradata dopo 48 ore in coltura statica (Figura 2J). Lo stroma mostrava un aspetto poroso e bucherellato, e un significativo distacco del sinciziotrofoblasto dallo stroma era evidente nelle regioni più grandi (Figura 2J, frecce)3. CD34IILa colorazione CD34II è stata impiegata per visualizzare le cellule endoteliali e, di conseguenza, i vasi sanguigni feto-placentari all’interno degli espianti villosi (Figura 2K-O). Il tessuto che è stato direttamente incorporato subito dopo la dissezione ha mostrato una disposizione distintamente organizzata delle cellule endoteliali (Figura 2K). L’integrità morfologica dei vasi sanguigni feto-placentari è rimasta ben mantenuta dopo 24 ore di coltura a flusso e spesso anche dopo 48 ore, anche se sono stati osservati casi occasionali di vasi sanguigni collassati in condizioni di flusso (Figura 2 L,N). Tuttavia, dopo 24 ore di coltura statica, i vasi sanguigni hanno mostrato un collasso parziale, come evidenziato dal loro aspetto visivo interrotto (Figura 2M, indicata da punte di freccia). Questo deterioramento dei vasi sanguigni all’interno dell’ambiente di coltura statico sembrava esacerbarsi con il prolungamento del tempo di coltivazione. In sintesi, la valutazione morfologica descrittiva degli espianti villosi successivi sia alla coltura a flusso che a quella statica ha indicato che l’integrità tissutale sembra essere preservata in modo più efficace all’interno del sistema di flusso rispetto alla modalità di coltura statica3. Analisi ultrastrutturale del tessuto coltivato Microscopia elettronica a trasmissionePer condurre un esame più dettagliato della morfologia degli espianti villosi, sono state eseguite ulteriori analisi ultrastrutturali utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) (Figura 3A-E). Questi risultati hanno corroborato i risultati delle indagini istologiche. Nel tessuto che è stato direttamente incorporato subito dopo la preparazione, la morfologia era eccezionalmente ben conservata (Figura 3A). I microvilli erano chiaramente distinguibili sulla superficie del sinciziotrofoblasto. Il sinciziotrofoblasto presentava il suo caratteristico strato continuo senza confini cellulari laterali, stabilendo un contatto diretto con la membrana basale. Lo stroma del tessuto fresco presentava un impacchettamento denso senza perforazioni o rotture significative. Inoltre, anche l’aspetto ultrastrutturale dei vasi sanguigni e degli eritrociti intravascolari individualizzati ha dimostrato un’eccellente conservazione (Figura 3A). Anche dopo 24 ore di coltura a flusso, la morfologia complessiva dei campioni di tessuto è rimasta relativamente ben mantenuta (Figura 3D). Mentre c’erano un po’ meno microvilli sulla superficie del sinciziotrofoblasto rispetto al tessuto fresco, il sinciziotrofoblasto è rimasto principalmente attaccato alla membrana basale. Nuclei e occasionali piccoli vacuoli erano osservabili all’interno della porzione interna del sinciziotrofoblasto. Lo stroma all’interno dei villi placentari appariva ben conservato e assomigliava molto al tessuto fresco (Figura 3D). Anche dopo 48 ore di coltura a flusso, le cellule stromali hanno mostrato una conservazione relativamente buona, anche se con alcune perforazioni presenti (Figura 3E). Curiosamente, le goccioline lipidiche sono state rilevate all’interno del tessuto. Mentre il sinciziotrofoblasto mostrava vacuoli e una riduzione del numero di microvilli, rimaneva attaccato alla membrana basale in numerose regioni e i nuclei sinciziali e cellulari erano chiaramente visibili (Figura 3E). In netto contrasto con il tessuto della coltura a flusso, la morfologia del tessuto villoso sottoposto a coltura statica ha mostrato un deterioramento già dopo 24 ore (Figura 3B). Il sinciziotrofoblasto si è dissociato dalla membrana basale in più siti e ha mostrato perforazioni relativamente sostanziali. Inoltre, le goccioline lipidiche erano frequentemente evidenti sia nel sinciziotrofoblasto che nello stroma (Figura 3B). Dopo 48 ore di coltura statica, è stato evidente un progressivo declino dell’ultrastruttura (Figura 3C). Il sinciziotrofoblasto presentava numerose perforazioni e distacchi dalla membrana basale in misura considerevole. L’identificazione delle cellule all’interno dello stroma, così come delle cellule endoteliali che compongono i vasi sanguigni, è diventata difficile. Inoltre, c’è stato un notevole accumulo di goccioline lipidiche all’interno degli espianti villosi dopo 48 ore di coltura statica (Figura 3C). In sintesi, l’ultrastruttura del tessuto in coltura statica ha mostrato un deterioramento successivo per tutta la durata del periodo di coltivazione, una tendenza che è stata mitigata dalla coltivazione in condizioni di flusso3. Microscopia elettronica a scansioneUtilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM), è stato facilitato un esame dettagliato della superficie degli espianti villosi (Figura 4A-J). Il tessuto che era stato appena incorporato mostrava una serie densamente popolata di microvilli su tutta la sua superficie (Figura 4 A,B). Alcune regioni hanno mostrato strutture simili a vescicole. Al contrario, il tessuto della coltura statica ha manifestato una sostanziale riduzione dei microvilli dopo 24 ore (Figura 4C,D), una riduzione che è persistita dopo 48 ore (Figura 4E,F). Mentre alcune aree mostravano un’aggregazione di strutture simili a vescicole che non erano state rilasciate, altre regioni apparivano spoglie ed erose (Figura 4D,F). Nei tessuti sottoposti a coltura a flusso, i microvilli erano ancora presenti in superficie dopo 24 ore (Figura 4G,H), così come dopo 48 ore (Figura 4I,J), anche se in misura minore rispetto ai tessuti freschi. Rispetto alla coltura statica, la prevalenza di strutture simili a vescicole sulla superficie è diminuita. Curiosamente, queste strutture simili a vescicole erano particolarmente concentrate in recessi specifici in cui il flusso poteva essere ridotto o assente (Figura 4H,J), suggerendo che potrebbero essere state spostate dalla superficie del tessuto esposto al flusso a causa del flussodel mezzo 3. Figura 1: Messa a punto del sistema di flusso. (A) Il sistema di flusso assemblato, costituito dal serbatoio e da cinque camere di flusso, è collegato a una delle pompe peristaltiche. Sul lato destro si trova una piastra a sei pozzetti in cui gli espianti vengono coltivati staticamente. (B,C) Per entrambi i metodi di coltivazione, i campioni placentari vengono sezionati in espianti villi di circa 0,5 cm2, di cui vengono poi utilizzati quattro espianti per pozzetto o camera. In un approccio sperimentale, vengono utilizzate cinque camere o pozzi. (D,E) Per la coltura a flusso, viene utilizzata una piastra metallica con rilievi stretti a forma di ago per fissare gli espianti. (F,G) Le aperture dei tubi si trovano all’inizio delle camere e vengono quindi utilizzate capovolte per garantire che il tessuto sia esposto al flusso diretto. Questa figura è riprodotta da Kupper et al.3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Analisi morfologica degli espianti dei villi placentari in coltura statica e a flusso. (A-E) Colorazione in immunofluorescenza per β-actina per visualizzare il citoscheletro degli espianti in coltura. Per l’analisi, sono stati utilizzati sei punti selezionati in modo casuale per vetrino. Vengono mostrate immagini rappresentative. (A) Visualizzazione del citoscheletro del tessuto incorporato subito dopo la preparazione. Barra della scala: 20 μm. (B-E) Rappresentazione rappresentativa della degenerazione del citoscheletro di actina dipendente dal tempo e dalla modalità di coltivazione in espianti di coltura a flusso e statici. (C-E) Gli asterischi indicano un aumento dell’accumulo di microfilamenti di actina, che è un’indicazione della degradazione del citoscheletro di actina. (F-J) Colorazione con ematossilina-eosina di espianti villosi. Barra della scala: 100 μm. (F,G) Gli espianti di tessuto appena incorporati (F) e di coltura a flusso per 24 ore (G) mostrano una morfologia ben conservata di un espianto villoso. (I) Gli espianti in coltura a flusso per 48 ore mostrano aree distaccate in modo intermittente del sinciziotrofoblasto (freccia). (H,J) Deterioramento dipendente dal tempo dell’integrità strutturale dopo coltura statica di espianto, indicato dallo spostamento del sinciziotrofoblasto (freccia) e dallo stroma perforato. (K-O) CD34 II è stato utilizzato per colorare le cellule endoteliali villose. Barra della scala: 100 μm. (K,L) Il tessuto fresco (K) e gli espianti coltivati per 24 ore in condizioni di flusso (L) presentano un caratteristico pattern di cellule endoteliali strutturalmente allineate. (N) Dopo 48 ore in coltura a flusso, l’integrità vascolare diminuisce in una certa misura. (M,O) Nella coltura statica, i vasi sanguigni collassati sono già visibili dopo 24 ore (M), che è stato osservato aumentare con un tempo di coltura statico più lungo (O). Questa figura è riprodotta da Kupper et al.3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Esame ultrastrutturale pre- e post-colturale di espianti villosi mediante microscopia elettronica a trasmissione. Per analizzare le immagini è stato utilizzato il tessuto di tre esperimenti indipendenti. (A) Un’immagine rappresentativa del tessuto appena incorporato mostra una grande quantità di microvilli (MV) sulla superficie del sinciziotrofoblasto (ST). Capillari (Ca) strutturalmente intatti sono visibili nello stroma (S) ben conservato. (B) Nel tessuto che è stato coltivato staticamente per 24 ore, c’è un deterioramento dell’integrità strutturale del sinciziotrofoblasto, che sembra essere scollegato dalla membrana basale in alcune aree. C’è anche un notevole accumulo di goccioline lipidiche (LD). (C) Dopo 48 ore in coltura statica, si osserva un grave deterioramento ultrastrutturale. Lo stroma e il sinciziotrofoblasto sono perforati ed è evidente un massiccio accumulo di goccioline lipidiche. I vasi sanguigni potevano essere tracciati a malapena. (D,E) L’ultrastruttura del tessuto della coltura a flusso era relativamente ben conservata dopo 24 ore (D) e dopo 48 ore (E). Barra della scala: 2 μm. MV: Microvilli, ST: Sinciziotrofoblasto, S: Stroma, Ca: Capillare, LD: Goccioline lipidiche. Questa figura è riprodotta da Kupper et al.3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Esame ultrastrutturale pre- e post-colturale di espianti villosi mediante microscopia elettronica a scansione. (A,C,E,G,I) Immagini generali della superficie degli alberi villosi placentari con le rispettive immagini dettagliate (B,D,F,H,J). (A,B) Il tessuto appena incorporato mostra una densa vena di microvilli. (B) In alcune località si possono notare strutture simili a vescicolari. (C-F) Dopo 24 ore e 48 ore in coltura statica, è visibile una diminuzione dei microvilli sulla superficie del sinciziotrofoblasto. Colpisce l’ampio accumulo di particelle vescicolari sulla superficie dell’espianto. (F) Le particelle sembrano appassire dopo 48 ore in coltura statica. (G-J) La superficie del tessuto della coltura a flusso sembra essere meglio conservata dopo 24 ore (G,H) e dopo 48 ore (I,J) rispetto alla coltura statica. I microvilli sono visibili in superficie (H,J), anche se non nella stessa alta densità del tessuto fresco. (B) Le particelle vescicolari possono essere viste sparse nelle nicchie con flusso ridotto. Questa figura è riprodotta da Kupper et al.3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella supplementare 1: Impostazioni sperimentali per il flusso dei villi placentari e la coltura statica. Fare clic qui per scaricare il file. Tabella supplementare 2: Specifiche del sistema di flusso e statico. Fare clic qui per scaricare il file. Tabella supplementare 3: Anticorpi per immunoistochimica e immunofluorescenza utilizzati per questo studio. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

Questo studio introduce una prospettiva unica su una tecnica di coltura a flusso per espianti placentari progettata per replicare la dinamica dell’ambiente in utero 3,23. I risultati rivelano che la morfologia del tessuto coltivato in condizioni di flusso è meglio conservata rispetto al tradizionale metodo di coltivazione statica3. In particolare, anche se né le condizioni statiche né quelle di coltura a flusso facilitano la perfusione dei vasi placentari, la distruzione dei vasi sanguigni feto-placentari all’interno dello stroma villoso è stata osservata prevalentemente in coltura statica, mentre l’integrità dei vasi sanguigni sembrava essere meglio mantenuta per una durata più lunga nella coltura a flusso3.

Una possibile spiegazione di questa osservazione potrebbe essere legata al cruciale ruolo protettivo ed endocrino del sinciziotrofoblasto, una funzione ben documentata in letteratura 12,24,25,26. Alla luce di ciò, è ipotizzabile che l’integrità complessiva dello strato esterno dei villi contribuisca in modo significativo al mantenimento dello stroma sottostante, compresi i vasi sanguigni. Di conseguenza, l’integrità cellulare sostenuta dei vasi sanguigni in condizioni di flusso potrebbe essere attribuita al flusso continuo del mezzo. Questo movimento aiuta il movimento passivo degli espianti, facilitando lo scambio di gas, sostanze nutritive e nanoparticelle (come le vescicole extracellulari) attraverso la barriera placentare. Questo, a sua volta, potrebbe avere un impatto positivo sulla conservazione della morfologia dei vasi sanguigni. Inoltre, il fenomeno della meccanosensazione gioca un ruolo nella morfogenesi tissutale in vari tessuti27,28. Gli studi hanno dimostrato che la meccanosensibilità influenza i processi cellulari a più livelli, innescando una serie di risposte biochimiche che alla fine influenzano la funzionalità dei tessuti e degli organi29. In particolare, le proteine meccanosensibili sono espresse dal sinciziotrofoblasto durante la gestazione28. Inoltre, lo studio suggerisce che i microvilli sulla superficie del tessuto possono essere implicati in questo contesto28.

Un’ulteriore prospettiva che vale la pena considerare è il potenziale ruolo dei mitocondri nella risposta cellulare al flusso. Ad esempio, nelle cellule endoteliali, i mitocondri fungono da trasduttori di segnale per le risposte cellulari agli stimoli ambientali30. L’aumento dell’accumulo di goccioline lipidiche, osservato nel tessuto in coltura statica attraverso TEM3, è stato associato all’induzione dell’apoptosi a causa della disfunzione mitocondriale31. Sono necessarie ulteriori indagini per svelare i meccanismi sottostanti e i fattori chiave, collegandoli alle vie di segnalazione a valle. Questa esplorazione potrebbe migliorare la nostra comprensione di come il tessuto percepisce e reagisce allo stress di taglio, traducendosi in una migliore vitalità e integrità degli espianti di villi in coltura23.

Diversi passaggi critici del protocollo devono essere ripetuti ed eseguiti con cura. Dopo il parto placentare, il tessuto deve essere coltivato il più rapidamente possibile. Durante la preparazione dell’espianto, è fondamentale evitare le aree con infarti visibili. È importante maneggiare delicatamente gli espianti con una pinza per evitare la compressione. Si raccomanda di mantenere il tessuto coperto di liquido durante tutta la procedura e di condurla rapidamente.

È importante riconoscere che questo studio non è in grado di specificare l’esatta sollecitazione di taglio all’interno del sistema di flusso presentato, il che dovrebbe essere considerato come una limitazione nelle indagini future 3,23. Tuttavia, è importante riconoscere che la velocità precisa del flusso e lo sforzo di taglio per uno specifico villo placentare in vivo sono influenzati da numerosi parametri, come le caratteristiche geometriche dello spazio intervilloso, la posizione del villo all’interno di questo spazio e la sua vicinanza e angolo alle arterie a spirale materne e alle vene uterine 3,19,23,32 . Va presa in considerazione anche la complessità della struttura geometrica della placenta, che varia da individuoa individuo 23,32. Esistono già modelli matematici per la stima del flusso sanguigno all’interno dello spazio intervilloso32 e calcoli sullo sforzo di taglio della parete sul sinciziotrofoblasto 19,28. È interessante notare che uno studio ha previsto che lo sforzo di taglio sul sinciziotrofoblasto è inferiore nel terzo trimestre rispetto al primo trimestre28, mentre un altro ha dimostrato uno sforzo di taglio della parete spazialmente eterogeneo sul sinciziotrofoblasto19. Determinare la velocità precisa del flusso e lo sforzo di taglio per uno specifico villo placentare rimane una sfida 3,19,23,32. Tali calcoli offrono un’approssimazione dell’intervallo di sollecitazione di taglio per indagini future, ma possono richiedere continui aggiustamenti anatomici e ottimizzazioni23. Inoltre, studi futuri potrebbero sviluppare nuove e raffinate tecniche di coltura flow-through che tengano conto dell’intricata geometria dello spazio intervilloso e delle strategie per aumentare il numero di campioni per esperimento3. Si prevede che il progresso e lo sviluppo in corso del sistema di flusso utilizzino, potenzialmente impiegando camere di flusso alternative (Brugger et al., dati non pubblicati, 2023).

In conclusione, questo studio getta solide basi dimostrando una tecnica di coltura a flusso ex vivo facilmente implementabile che sostiene l’integrità strutturale degli espianti di villi coltivati. Sottolinea l’importanza delle tecniche dinamiche negli studi di biologia funzionale placentare, aprendo la strada a ulteriori progressi nei sistemi di coltura a flusso e alla generazione di nuove idee e ipotesi 3,23.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori apprezzano con gratitudine l’eccellente supporto tecnico di Bettina Amtmann e Petra Winkler per il campionamento dei tessuti. Questa ricerca è stata finanziata dall’Austrian Science Fund FWF (DOC 31-B26) e dall’Università di Medicina di Graz, Austria, attraverso il programma di dottorato Disturbi infiammatori in gravidanza (DP-iDP).

Materials

6-well plates NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 140675
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA A21422 Diluted in PBS, 1:200
antibody diluent Dako, Santa Clara, CA, USA S3022
anti-β-actin (AC-15) Abcam, Cambridge, UK ab6276 Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000
Bioreactor TEB500 TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117
CD34 Class II (QBEnd-10) Dako, Santa Clara, CA, USA M7165 Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500
CPD 030 critically point dryer Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) Critically point dryer
DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA D21490 Diluted in PBS, 1:1000
Ebers TEB505 Series Software TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain  Series Software 1.4
Endothelial Cell Growth Medium MV PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany;  C-22120 Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used
Excelsior AS Tissue Processor  ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Exosome-depleted fetal bovine serum Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA A2720803
Histolab Clear Histolab, Askim, Sweden 14250-TY
Hydrogen Peroxide Block ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TA125H202Q
Kaiser’s Glycerin Gelatine Merck, Darmstadt, Germany 1092420100
Leica DM 6000 B microscope Leica, Wetzlar, Germany Equipped with an Olympus DP 72 Camera
Leica UC7 ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna, Austria)
Metal plate with needles In-house construction
Microtome  Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Microwave oven Miele, Guetersloh, Germany
Olympus microscope  (BX63) Olympus, Hamburg, Germany Serial Number: 1A52421
PBS ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Penicillin/Streptomycin  Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 2585627
Primary antibody enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TL-125-PB
ProLong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA P36934
Pumping tube Tygon, Bartelt, Graz, Austria 6.078 175  1.02 mm diameter 
QV500 Flow chambers Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK QV500  Other chambers would work as well
SCD 500, sputter coater Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein Sputter coater
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit Abcam, Cambridge, UK ab64252
Superfrost Plus slides  Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
Syringe Filter Corning Incorporated, NY, USA 431219 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle 
TAAB epoxy resin Agar Scientific, Stansted, Essex, UK T001
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer  ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TL-125-HL
UltraVision Protein Block ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TA125BPQ
Zeiss EM 900 transmission electron microscope Zeiss, Oberkochen, Germany
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope Zeiss, Cambridge, UK Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage
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References

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Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. Ex Vivo Placental Explant Flow Culture – Mimicking the Dynamic Conditions In Utero. J. Vis. Exp. (199), e65919, doi:10.3791/65919 (2023).
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