Ex Vivo(エクス・ビボ)胎盤外植体フロー培養 - 子宮内の動的条件の模倣

この出版物の一部とその結果は、すでに公開されています(参考文献3および23を参照)。 実験装置実験的なセットアップを図1に示します。複合フローサイクルは、直列に相互接続された5つのフローチャンバーで構成されています(図1A)。各フローチャンバー内では、それぞれ断面直径約0.5cmの4つの外植片が培養されます(図1A、C)。静電気防除実験では、外植片を6ウェルプレートの個々のウェルで培養します(図1B)。外植片が洗い流されるのを防ぐために、細い針状の突起を特徴とする金属板に貼り付けます(図1 D、E)。外植片を培地の直接流にさらすために、チャンバーは反転し、入口と出口はヘッドセクションに配置されています(図1 F、G)。バイオリアクター内では、フローサイクルは蠕動ポンプにリンクされています。フロー培養組織と従来の静的培養組織との間の組織完全性を比較する目的で、外植片はフローサイクルに隣接する6ウェルプレートに配置されます。これにより、酸素、温度、湿度に関して一貫した培養条件を検証できます(図1A)3。 形態素解析 β-アクチンさまざまな培養条件に関連する組織の完全性における組織学的違いを調べるために、さまざまな免疫組織化学的染色手順を実施しました(図2)。解剖後速やかに包埋された外植片は、ベースラインの基準として機能しました。絨毛外植片内のアクチン細胞骨格の解析のために、β-アクチン染色を実施しました(図2A-E)。記述的解析により、新たに得られた組織における細胞骨格のよく構造化され組織化された視覚的提示が明らかになりました(図2A)。時間が経つにつれて、培養が進むにつれて、細胞骨格構造の劣化を示すマイクロフィラメントの観察可能な凝集がありました。この現象は、静的培養を受けた絨毛外植片で一貫して観察されました3(図2C、E、アスタリスクで示しました)。 H&E染色H&E染色は、静的培養の過程で組織の完全性が低下するという観察結果をさらに補強し、この傾向はフロー培養の文脈で改善されます(図2F-J)。新鮮な組織は、絨毛外植片の構造化された特徴的な組織学的症状を示し、密集した密集した間質を特徴としました(図2F)。さらに、合胞体栄養芽細胞は、その下にある間質にしっかりと接着していました(図2F)。流動環境で24時間培養した絨毛外植片でも同様の外観が認められました(図2G)。しかし、流下での培養の48時間後、合胞体栄養芽細胞の一部が部分的に剥離し(図2I、矢印で示)、間質内に散発的な小さな裂孔を伴うことが観察されました。組織の組織学的精査により、静的培養条件での24時間後の組織の完全性は不十分に維持されることが示されました(図2H)。さらに、この完全性は、静置培養で48時間後にさらに著しく低下しました(図2J)。間質は多孔質で凹んだ外観を示し、間質からの合胞体栄養芽細胞の有意な剥離は、より広い領域で明らかでした(図2J、矢印)3。 CD34IIのCD34II染色は、絨毛外植片内の内皮細胞、ひいては胎児胎盤血管を可視化するために用いられました(図2K-O)。解剖直後に直接包埋された組織は、内皮細胞の独特な組織化された配置を示しました(図2K)。胎児胎盤血管の形態学的完全性は、フロー培養の24時間後も良好に維持され、48時間後も頻繁に維持されましたが、フロー条件下では血管の虚脱の事例が時折認められました(図2 L、N)。しかし、24時間の静置培養後、血管は部分的な虚脱を示し、その破壊された視覚的外観によって証明されました(図2M、矢印で示しました)。静置培養環境内での血管のこの劣化は、培養時間が長くなると悪化するように見えました。要約すると、フロー培養と静的培養の両方に続く絨毛外植片の記述的形態学的評価は、静的培養モード3と対比した場合、組織の完全性がフローシステム内でより効果的に維持されるように見えることを示しました。 培養組織の微細構造解析 透過型電子顕微鏡絨毛外植片の形態をより詳細に調べるために、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて追加の超微細構造解析を行いました(図3A-E)。これらの所見は、組織学的検査の結果を裏付けるものであった。調製直後に直接包埋された組織では、形態が非常に良好に保存されていました(図3A)。微絨毛は合胞体栄養膜の表面ではっきりと識別できました。合胞体栄養芽細胞は、横方向の細胞境界のない特徴的な連続層を示し、基底膜との直接接触を確立しました。新鮮な組織の間質は、著しい穿孔や破裂を伴わずに密集したパッキングを示しました。さらに、血管の微細構造と個別化された血管内赤血球も優れた保存性を示しました(図3A)。 24時間フロー培養後も、組織サンプルの全体的な形態は比較的良好に維持されていました(図3D)。合胞体栄養芽細胞の表面の微絨毛は新鮮組織と比較してわずかに少なかったが、合胞体栄養芽細胞は主に基底膜に付着したままであった。核と時折の小さな液胞が合胞体栄養膜の内側で観察されました。胎盤絨毛内の間質は保存状態が良好で、新鮮な組織によく似ていました(図3D)。48時間のフロー培養後でも、間質細胞は、多少の穿孔はあるものの、比較的良好な保存状態を示しました(図3E)。興味深いことに、脂質滴が組織内で検出されました。合胞体栄養芽細胞は液胞と微絨毛数の減少を示しましたが、多くの領域で基底膜に付着したままであり、合胞体と細胞核がはっきりと見えました(図3E)。 フロー培養の組織とは対照的に、静的培養を行った絨毛組織の形態は、24時間という早い時間で劣化を示しました(図3B)。合胞体栄養芽細胞は複数の部位で基底膜から解離し、比較的大きな穿孔を示した。さらに、脂質滴は合胞体栄養膜と間質の両方で頻繁に明らかでした(図3B)。静置培養を48時間行うと、超微細構造の漸進的な低下が明らかになりました(図3C)。合胞体栄養膜は、かなりの程度まで多数の穿孔と基底膜からの剥離を示しました。間質内の細胞や血管を構成する内皮細胞の同定が困難になりました。さらに、静置培養の48時間後に絨毛外植片内に脂質滴が顕著に蓄積しました(図3C)。要約すると、静置培養における組織の超微細構造は、培養期間にわたって連続的な劣化を示し、この傾向は流動条件下での培養によって緩和された3。 走査型電子顕微鏡走査型電子顕微鏡(SEM)を利用して、絨毛外植片の表面の詳細な検査が容易になりました(図4A-J)。新たに包埋された組織は、その表面全体に密集した微絨毛の配列を示しました(図4 A、B)。一部の領域では、小胞状の構造が見られました。対照的に、静的培養の組織では、24時間後に微絨毛の大幅な減少が見られ(図4C、D)、48時間後も減少が持続しました(図4E、F)。一部の領域では、放出されていない小胞状構造の凝集が見られましたが、他の領域は裸で侵食されているように見えました(図4D、F)。フロー培養を行った組織では、微絨毛は24時間後(図4G、H)および48時間後(図4I、J)後も表面に存在していましたが、その程度は新鮮組織よりも少なかった。静的培養と比較して、表面上の小胞様構造の有病率は減少しました。興味深いことに、これらの小胞状構造は、流れが減少または不在になり得る特定のくぼみに顕著に集中しており(図4H、J)、培地の流れによって流れに露出した組織表面から剥がれた可能性があることを示唆しています3。 図1:フローシステムのセットアップ。 (A)リザーバーと5つのフローチャンバーで構成される組み立てられたフローシステムは、蠕動ポンプの1つに接続されています。右側には、外植片を静的培養する6ウェルプレートがあります。(B、C)どちらの培養方法でも、胎盤サンプルを約0.5cm2の絨毛外植片に解剖し、そのうち4つの外植片をウェルまたはチャンバーごとに使用します。実験的アプローチでは、5つのチャンバーまたはウェルが使用されます。(D、E)フロー培養では、針状の高さが狭い金属板を使用して外植片を固定します。(F、G)チューブの開口部はチャンバーの頭部にあるため、組織が直接流れにさらされることを保証するために逆さまに使用されます。この図は Kupper et al.3 からの転載です。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図2:胎盤絨毛外植片の流動培養および静置培養時の形態学的解析。 (A-E)培養時に外植片の細胞骨格を可視化するためのβ-アクチンの免疫蛍光染色。分析には、スライドごとに無作為に選択された6つのスポットを使用しました。代表的な画像を示します。(A)調製直後の包埋組織の細胞骨格の可視化。スケールバー:20μm。 (B-E)フロー培養および静的培養の培養外植片におけるアクチン細胞骨格の時間依存的および培養モード依存的な変性の両方の代表的な描写。(C-E)アスタリスクはアクチンマイクロフィラメントの蓄積の増加を意味し、アクチン細胞骨格の分解を示します。(F-J)絨毛外植片のヘマトキシリン-エオシン染色。スケールバー:100 μm。 (F,G) 新たに包埋した組織(F)および24時間(G)のフロー培養外植片は、絨毛外植片のよく保存された形態を示します。(I)48時間流動培養した外植片は、合胞体栄養膜の断続的な剥離領域を示す(矢印)。(H,J)静的外植片培養後の構造的完全性の経時的な劣化は、合胞体栄養芽細胞(矢印)の脱落と穿孔間質によって示されます。(K-Oさん)CD34 IIは、絨毛内皮細胞の染色に使用されました。スケールバー:100μm。 (K,L) フロー条件下で24時間培養した新鮮組織(K)および外植片(L)は、特徴的な構造的に整列した内皮細胞パターンを示します。(N)フロー培養で48時間後、血管の完全性がある程度低下する。(男性、男性)静置培養では、24時間後にはすでに潰れた血管が見えており(M)、静置培養時間が長くなるほど増加することが観察されました(O)。この図は Kupper et al.3 からの転載です。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3:透過型電子顕微鏡を用いた絨毛外植片の培養前および培養後の超微細構造検査。 3つの独立した実験の組織を使用して画像を解析しました。(A)新たに包埋された組織の代表的な画像は、合胞体栄養芽細胞(ST)の表面に大量の微絨毛(MV)を示しています。構造的に無傷の毛細血管(Ca)は、保存状態の良い間質(S)に見られます。(B)24時間静的培養した組織では、合胞体栄養膜の構造的完全性が低下しており、一部の領域で基底膜から切断されているように見えます。脂質滴(LD)の蓄積も顕著です。(C)静置培養で48時間後、重度の超微細構造劣化が認められる。間質と合胞体栄養膜には穿孔があり、脂質滴の大量の蓄積が明らかです。血管はほとんど痕跡が残っていなかった。(D、E)フロー培養による組織の超微細構造は、24時間後(D)および48時間後(E)で比較的良好に保存されました。スケールバー:2 μm。 MV:微絨毛、ST:合胞体栄養芽細胞、S:間質、Ca:毛細血管、LD:脂質滴。この図は Kupper et al.3 からの転載です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図4:走査型電子顕微鏡を用いた絨毛外植片の培養前および培養後の微細構造検査。 (A、C、E、G、I) 胎盤絨毛樹木の表面の概観画像とそれぞれの詳細画像(B、D、F、H、J)。(A,B)新たに埋め込まれた組織は、微絨毛の密な継ぎ目を示します。(B)小胞状の構造が所々に見られる。(C-F)静置培養で24時間および48時間後、合胞体栄養芽細胞の表面の微絨毛の減少が見られます。印象的なのは、外植片の表面に小胞状の粒子が広範囲に蓄積していることです。(F)静置培養で48時間後に粒子が枯れるように見える。(G-J)フロー培養による組織の表面は、静的培養と比較して、24時間後(G,H)および48時間後(I,J)の方が保存状態が良好であるようです。微絨毛は表面(H、J)に見られますが、新鮮な組織ほど高密度ではありません。(B)小胞粒子は、流動が減少したニッチに散乱しているのが見られます。この図は Kupper et al.3 からの転載です。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 補足表1:胎盤絨毛流動および静置培養の実験設定。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 付表2:フローおよび静的システムの仕様。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足表3:この研究に使用した免疫組織化学および免疫蛍光法の抗体。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。