Ex Vivo (체외 주행) 태반 이식 유동 배양 - 자궁의 동적 조건 모방

이 출판물의 일부와 그 결과는 이미 출판되었습니다(참고 문헌 3 및 23 참조). 실험 설정실험 설정은 그림 1에 나와 있습니다. 복합 유동 사이클은 직렬로 상호 연결된 5개의 유동 챔버로 구성됩니다(그림 1A). 각 유동 챔버 내에는 각각 단면적이 약 0.5cm인 4개의 외식이 배양됩니다(그림 1 A,C). 정적 제어 실험의 경우, 외식은 6웰 플레이트의 개별 웰에서 배양됩니다(그림 1B). 외식이 씻겨 나가는 것을 방지하기 위해 좁은 바늘 모양의 돌출부가 있는 금속판에 부착됩니다(그림 1 D,E). 외식물을 매체의 직접적인 흐름에 적용하기 위해 챔버는 입구와 출구가 헤드 섹션에 위치하도록 반전됩니다(그림 1 F,G). 생물반응기 내에서 유량 사이클은 연동 펌프에 연결됩니다. 유동 배양 조직과 종래의 정적 배양 조직 사이의 조직 무결성을 비교하기 위해, 외식은 유동 주기에 인접한 6웰 플레이트에 배치됩니다. 이를 통해 산소, 온도 및 습도 측면에서 일관된 배양 조건을 검증할 수 있습니다(그림 1A)3. 형태학적 분석 β-액틴다양한 배양 조건과 관련된 조직 무결성의 조직학적 차이를 조사하기 위해 다양한 면역조직화학적 염색 절차가 수행되었습니다(그림 2). 해부 후 즉시 삽입된 외식이 기준 참조 역할을 했습니다. 융모 외식물 내의 액틴 세포골격 분석을 위해 β-액틴 염색을 수행했습니다(그림 2A-E). 기술 분석은 갓 얻은 조직에서 세포골격의 잘 구조화되고 조직화된 시각적 표현을 보여주었습니다(그림 2A). 시간이 지남에 따라 재배가 진행됨에 따라 미세 필라멘트의 관찰 가능한 응집이 있었으며, 이는 세포골격 구조의 저하를 의미합니다. 이 현상은 정적 배양(staticcultivation)3을 거친 융모 외식(villous explant)에서 일관되게 관찰되었다(그림 2C,E, 별표로 표시). H&E 염색H&E 염색은 정적 배양 과정에서 조직 무결성이 감소한다는 관찰을 추가로 강화했으며, 이러한 경향은 유동 배양의 맥락에서 개선됩니다(그림 2F-J). 신선한 조직은 조밀하고 조밀하게 포장된 기질이 특징인 융모 외피의 구조화되고 특징적인 조직학적 표현을 나타냈습니다(그림 2F). 또한, 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast)는 기저 기질(substerma)에 단단히 부착되어 있었습니다(그림 2F). 24시간 동안 유동 환경에서 배양한 융모 외식에서 유사한 모양이 관찰되었습니다(그림 2G). 그러나, 유동 하에서 48시간 동안 배양한 후, 세포융합영양세포의 일부가 부분적으로 분리되는 것이 관찰되었으며(그림 2I, 화살표로 표시), 기질 내에 산발적인 작은 틈새가 동반되었습니다. 조직의 조직학적 정밀 조사는 정적 배양 조건에서 24시간 후 조직의 무결성이 부적절하게 보존되었음을 나타냈습니다(그림 2H). 더욱이, 이 무결성은 정적 배양에서 48시간 후에 현저하게 더욱 저하되었습니다(그림 2J). 기질은 다공성(porous)이고 움푹 패인 모양을 나타냈으며, 기질에서 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast)의 상당한 분리는 더 큰 영역에서 분명했습니다(그림 2J, 화살표)3. CD34II (CD34II)CD34II 염색을 사용하여 내피 세포를 시각화하고 결과적으로 융모 외피 내의 태아-태반 혈관을 시각화했습니다(그림 2K-O). 절개 직후 직접 삽입된 조직은 내피 세포의 독특하게 조직화된 배열을 보여주었습니다(그림 2K). 태아-태반 혈관의 형태학적 완전성은 유동 배양 24시간 후 그리고 종종 48시간 후에도 잘 유지되었지만, 유동 조건에서 간혹 혈관이 붕괴되는 사례가 관찰되었습니다(그림 2 L,N). 그러나 24시간의 정적 배양 후 혈관은 시각적으로 흐트러진 모습으로 입증된 바와 같이 부분적인 붕괴를 보였습니다(그림 2M, 화살촉으로 표시). 정적 배양 환경에서 이러한 혈관 악화는 배양 시간이 길어짐에 따라 악화되는 것으로 나타났습니다. 요약하면, 유동 및 정적 배양 모두에 따른 융모 외식에 대한 서술적 형태학적 평가는 정적 배양 모드3와 대조될 때 조직 무결성이 유동 시스템 내에서 더 효과적으로 보존되는 것으로 나타났다. 배양 조직의 초구조 분석 투과 전자 현미경융모 외식의 형태에 대한 보다 자세한 검사를 수행하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 추가 초미세 구조 분석을 수행했습니다(그림 3A-E). 이러한 발견은 조직학적 조사의 결과를 확증했다. 준비 직후 직접 삽입된 조직에서는 형태가 매우 잘 보존되었습니다(그림 3A). 미세융모(microvilli)는 세포융합영양인모세포(syncytiotrophoblast)의 표면에서 명확하게 식별될 수 있었다. 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast)는 측면 세포 경계가 없는 독특한 연속층을 나타내어 기저막과 직접 접촉합니다. 신선한 조직의 기질은 심각한 천공이나 파열 없이 조밀한 패킹을 나타냈습니다. 또한, 혈관의 초구조적 외관과 개별화된 혈관 내 적혈구도 우수한 보존을 보여주었습니다(그림 3A). 24시간의 유동 배양 후에도 조직 샘플의 전체 형태는 비교적 잘 유지되었습니다(그림 3D). 세포융합영양세포의 표면에는 신선한 조직에 비해 미세융모가 약간 적었지만, 세포융합영양세포는 주로 기저막에 부착되어 있었습니다. 핵(nuclei)과 간혹 작은 액포(small vacuoles)가 세포융합영양인세포(syncytiotrophoblast)의 안쪽 부분에서 관찰되었다. 태반 융모 내의 기질은 잘 보존된 것처럼 보였고 신선한 조직과 매우 흡사했습니다(그림 3D). 48시간의 유동 배양 후에도 기질 세포는 약간의 천공이 있기는 하지만 비교적 양호한 보존을 보였습니다(그림 3E). 흥미롭게도, 조직 내에서 지질 방울이 검출되었습니다. 세포융합영양세포는 액포와 미세융모의 수 감소를 보였지만 여러 부위의 기저막에 부착된 상태로 남아 있었고 세포핵과 세포핵이 명확하게 보였습니다(그림 3E). 유동 배양의 조직과는 대조적으로, 정적 배양을 받은 융모 조직의 형태는 빠르면 24시간 내에 악화를 나타냈습니다(그림 3B). 세포융합영양세포는 여러 부위에서 기저막에서 해리되어 비교적 상당한 천공을 보였다. 또한, 지질 방울은 세포융합 영양 세포와 기질 모두에서 자주 나타났습니다(그림 3B). 48시간의 정적 배양 후 초미세 구조의 점진적인 감소가 분명했습니다(그림 3C). 세포융합영양세포는 상당한 정도로 기저막에서 수많은 천공과 박리를 나타냈다. 혈관을 구성하는 내피 세포뿐만 아니라 기질 내의 세포를 식별하는 것이 어려워졌습니다. 또한, 정적 배양 48시간 후 융모 외엽 내에 지질 방울이 눈에 띄게 축적되었습니다(그림 3C). 요약하면, 정적 배양에서 조직의 초구조는 배양 기간 동안 연속적인 열화를 나타냈으며, 이러한 경향은 유동 조건 하에서 배양함으로써 완화되었습니다3. 주사 전자 현미경주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 융모 외피의 표면을 자세히 검사할 수 있었습니다(그림 4A-J). 갓 삽입된 조직은 표면 전체에 조밀하게 밀집된 미세융모 배열을 나타냈습니다(그림 4 A,B). 일부 지역은 소포와 같은 구조를 나타냈다. 대조적으로, 정적 배양에서 얻은 조직은 24시간 후(그림 4C,D), 48시간 후에도 지속된 감소(그림 4E,F)에서 상당한 미세융모 감소를 나타냈습니다. 어떤 지역은 방출되지 않은 소포와 같은 구조의 응집을 보였지만, 다른 지역은 벌거벗고 침식된 것처럼 보였다(그림 4D,F). 유동 배양된 조직에서, 미세융모는 24시간 후(그림 4G,H)와 48시간 후(그림 4I,J) 후에도 여전히 표면에 존재했지만, 신선한 조직에서보다 그 정도는 덜했습니다. 정적 배양과 비교했을 때, 표면에 소포와 같은 구조의 보급이 감소했습니다. 흥미롭게도, 이러한 소포 유사 구조는 흐름이 감소하거나 없을 수 있는 특정 홈에 현저하게 집중되어 있었으며(그림 4H,J), 이는 매체3의 흐름으로 인해 흐름에 노출된 조직 표면에서 제거되었을 수 있음을 시사합니다. 그림 1: 유량 시스템 설정 . (A) 저장소와 5개의 유량 챔버로 구성된 조립식 유량 시스템은 연동 펌프 중 하나에 연결됩니다. 오른쪽에는 외식이 정적으로 배양되는 6웰 플레이트가 있습니다. (나,씨) 두 가지 배양 방법 모두에서, 태반 샘플은 약 0.5cm2의 융모 외식(villous explant)으로 절개되며, 그 중 4개의 외식(explant)은 웰 또는 챔버(well or chamber)당 사용된다. 실험적 접근 방식에서는 5개의 챔버 또는 웰이 사용됩니다. (디,이) 유동 배양의 경우 좁은 바늘 모양의 돌출부를 가진 금속판을 사용하여 외식을 고정합니다. (에프,지) 튜브의 개구부는 챔버 헤드에 위치하므로 조직이 직접 흐름에 노출되도록 거꾸로 사용됩니다. 이 그림은 Kupper et al.3에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 유동 및 정적 배양에 따른 태반 융모 외식의 형태학적 분석. (A-E) 배양 시 외식의 세포골격을 시각화하기 위한 β-actin에 대한 면역형광 염색. 분석을 위해 슬라이드당 무작위로 선택된 6개의 지점이 사용되었습니다. 대표 이미지가 표시됩니다. (A) 준비 직후 내장된 조직의 세포골격 시각화. 척도 막대: 20 μm. (B-E) 유동 및 정적 배양의 배양된 외식에서 액틴 세포골격의 시간 의존적 및 배양 모드 의존적 변성의 대표적인 묘사. (씨-E) 별표는 액틴 마이크로필라멘트 축적 증가를 의미하며, 이는 액틴 세포골격 분해를 나타냅니다. (에프제이 ) 융모 외식의 Hematoxylin-eosin 염색. 척도 막대: 100 μm. (F,G) 갓 삽입된 조직(F)과 24시간(G) 동안 유동 배양 외식은 융모 외식의 잘 보존된 형태를 보여줍니다. (I) 48시간 동안의 유동 배양 외식은 세포융합영양세포(화살표)의 간헐적으로 분리된 영역을 보여줍니다. (H,J) 정적 외식 배양 후 구조적 무결성의 시간 의존적 악화, 세포융합 영양 세포(화살표) 및 천공된 기질의 이탈로 나타남. (K-O) CD34 II는 융모 내피 세포를 염색하는 데 사용되었습니다. 척도 막대: 100 μm. (K,L) 유동 조건(L)에서 24시간 동안 배양된 신선한 조직(K) 및 외식은 구조적으로 정렬된 특징적인 내피 세포 패턴을 나타냅니다. (N) 유동 배양에서 48시간 후, 혈관 무결성은 어느 정도 감소합니다. (남,오) 정적 배양에서 붕괴된 혈관은 24시간(M) 후에 이미 볼 수 있으며, 이는 정적 배양 시간(O)이 길어질수록 증가하는 것으로 관찰되었습니다. 이 그림은 Kupper et al.3에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 투과 전자 현미경을 사용한 융모 외피의 초구조적 배양 전후 검사. 세 가지 독립적인 실험의 조직을 사용하여 이미지를 분석했습니다. (A) 갓 삽입된 조직의 대표 이미지는 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast, ST)의 표면에 다량의 미세융모(microvilli, MV)를 보여줍니다. 구조적으로 온전한 모세혈관(Ca)은 잘 보존된 기질(S)에서 볼 수 있습니다. (B) 24시간 동안 정적으로 배양된 조직에서는 세포융합영양아세포의 구조적 무결성이 저하되어 일부 영역에서 기저막에서 분리된 것으로 보입니다. 또한 지질 방울(LD)이 눈에 띄게 축적됩니다. (C) 정적 배양에서 48시간 후, 심각한 초미세 구조 열화가 관찰됩니다. 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast)뿐만 아니라 기질(stroma)에 구멍이 뚫려 있고 지질 방울이 대량으로 축적되어 있는 것이 분명합니다. 혈관을 거의 추적할 수 없었다. (디,이) 유동 배양으로부터 조직의 초세구조는 24시간(D) 후 및 48시간(E) 후에도 비교적 잘 보존되었습니다. 척도 막대: 2 μm. MV: Microvilli, ST: Syncytiotrophoblast, S: Stroma, Ca: 모세관, LD: 지질 방울. 이 그림은 Kupper et al.3에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 주사 전자 현미경을 사용한 융모 외피의 초구조적 배양 전후 검사. (A,C,E,G,I) 각각의 상세 이미지(B,D,F,H,J)가 있는 태반 융모 나무 표면의 개요 이미지. (ᅡ,ᄂ) 갓 박힌 조직은 촘촘한 미세 융모의 이음새를 나타냅니다. (B) 일부 위치에서 Vesicular와 유사한 구조를 볼 수 있습니다. (C-F) 정적 배양에서 24시간 및 48시간 후, 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast) 표면의 미세융모(microvilli)가 감소하는 것을 볼 수 있습니다. 눈에 띄는 것은 외피의 표면에 소포와 같은 입자가 광범위하게 축적되어 있다는 것입니다. (F) 입자는 정적 배양에서 48시간 후에 시들게 됩니다. (G-J) 유동 배양에서 조직의 표면은 정적 배양에 비해 24시간(G,H) 후와 48시간(I,J) 후에 더 잘 보존되는 것으로 보입니다. 미세융모는 표면(H,J)에서 볼 수 있지만 신선한 조직에서와 같은 고밀도는 아닙니다. (B) 소포 입자는 감소된 흐름으로 틈새에 흩어져 있는 것을 볼 수 있습니다. 이 그림은 Kupper et al.3에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 표 1: 태반 융모 흐름 및 정적 배양을 위한 실험 설정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 표 2: 흐름 및 정적 시스템의 사양. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충표 3: 본 연구에 사용된 면역조직화학 및 면역형광용 항체. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.