Alivio de la nefropatía por IgA mediada por dioscina mediante la inhibición de la activación de las células B in vivo y la disminución de la producción de IgA1 deficiente en galactosa in vitro

El comité de ética del Hospital de Guanganmen aprobó este experimento (número de aprobación ética del experimento con animales: IACUC-GAMH-2023-003). 1. Preparación de los ratones para el procedimiento experimental Cría 22 ratones machos Balb/c de grado SPF (6-7 semanas de edad, peso corporal de 20-25 g) en el animalario del hospital/centro de investigación. Divida los animales en grupos de control (n = 8) y modelo (n = 14) utilizando el método de tabla de números aleatorios. Después de 1 semana de cría adaptativa en la jaula de laboratorio, alimentar al grupo modelo (grupo IgAN) con solución de gammaglobulina bovina (BGG) al 0,1% en agua acidificada que contenga 6 mmol/L de HCl durante 9 semanas según el protocolo de modelado de Zou et al.18. Inyecte 0,1 mL de solución de BGG al 0,1% en solución salina en la vena de cola durante 3 días consecutivos mientras continúa bebiendo solución de BGG para preparar un modelo experimental de ratón con IgAN18. Deje que el grupo de control beba libremente 6 mmol/L de agua acidificada HCl sin BGG durante 9 semanas. Inyecte el volumen correspondiente de solución salina en la vena de la cola durante 3 días consecutivos.NOTA: Los grupos de control y modelo fueron alimentados con la misma calidad que el alimento normal. Después de la inyección en la vena de cola, seleccione 2 ratones en el grupo de control y 2 ratones en el grupo modelo al azar y examínelos mediante proteinuria, microscopía óptica e inmunofluorescencia para determinar si el modelado fue exitoso.NOTA: No se proporciona comida a los animales, pero no se les prohíbe el agua; Registre la producción de orina. Recoger la orina durante 24 h en jaulas metabólicas y centrifugarla a 400 x g durante 5 min; Deseche los sedimentos de orina. Después de una dilución de 10 veces el sobrenadante, mida la concentración de proteinuria con un kit de ensayo de proteínas en orina y luego multiplique por el factor de dilución y el volumen de orina para obtener 24 h de proteína total en orina.NOTA: Los métodos de microscopía e inmunofluorescencia se muestran en las secciones 3 y 4, respectivamente. Después de preparar con éxito el modelo, divida 12 ratones en el grupo modelo en 6 ratones, cada uno en el grupo modelo (grupo IgAN) y en el grupo de sonda DIO (grupo DIO), de acuerdo con el método de la tabla de números aleatorios. Deje que el grupo de control continúe bebiendo 6 mmol/L de agua acidificada HCl sin BGG, y el grupo modelo de solución de BGG al 0,1% compuesta por agua acidificada que contenga 6 mmol/L de HCl. Calcule la dosis de administración de sonda nasogástrica del grupo DIO de acuerdo con la fórmula de conversión de dosis de la metodología experimental farmacológica (convertida de acuerdo con la masa corporal humana de 70 kg)19. Sonda nasogástrica DIO comprimidos de 0,06 g/kg una vez al día durante 8 semanas. Después de 8 semanas de sonda nasogástrica, anestesiar a los ratones por vía intraperitoneal con pentobarbital sódico al 0,4% (60 mg/kg), y después de confirmar la anestesia adecuada mediante pinzamiento del dedo del pie, aislar los riñones y el parche de Peyer para los análisis posteriores de microscopía óptica e inmunohistoquímica.NOTA: El esquema para el modelo in vivo se encuentra en la Figura Suplementaria 1. 2. Análisis histológico Secciones de parafina para riñones y parche de PeyerFijar tejidos renales de 3 mm de espesor o 1 parche de Peyer con paraformaldehído al 4% durante 24 h, deshidratar con etanol de gradiente y xileno. Sumergir en cera durante 2 h, sellar y congelar. Corte secciones de riñón de 2 μm de grosor y secciones de parche de Peyer de 4 μm de grosor y extiéndalas en agua tibia. Recoja las lonchas desplegadas con un portaobjetos de vidrio limpio y hornee en un horno de temperatura constante a 40 °C durante 1 h. Comience a teñir después del preprocesamiento de la muestra.NOTA: Tome la superficie coronal de la parte hiliar del riñón, con un bloque de tejido de 3 mm de grosor. Desparafinar y teñir las secciones de parafina a temperatura ambiente (RT) durante 10 min con solución de ácido peryódico, evitando la luz. Enjuague con agua destilada y seque la mancha con la solución de tinción de Schiff durante 20-30 minutos, evitando la luz. Enjuague con agua destilada hasta que las secciones estén rojas bajo el microscopio. Coloque las secciones en una solución de tinción de hematoxilina, tiña los núcleos durante 3 minutos (los núcleos teñidos demasiado profundamente se pueden dividir con clorhidrato de etanol) y enjuague con agua corriente hasta que los portaobjetos estén incoloros. Realice una deshidratación de rutina con concentraciones de gradiente de etanol y xileno, selle las secciones con goma neutra y observe bajo un microscopio. El PAS-positivo es rojo y el núcleo es azul. 3. Análisis inmunohistoquímico del parche de Peyer Prepare secciones de parafina del parche de Peyer como se describe en el paso 2.1.NOTA: El espesor de las secciones para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia posterior es de 4 μm. Desparafinar las secciones de parafina:Coloque las secciones en xileno I durante 5 minutos, xileno II durante 5 minutos y xileno III durante 5 minutos. Además, enjuague los portaobjetos con etanol anhidro I durante 5 minutos, etanol anhidro II durante 5 minutos, alcohol al 85% durante 5 minutos, alcohol al 75% durante 5 minutos. A continuación, enjuague los portaobjetos con agua destilada. Recuperación de antígenosPrepare 50 veces la solución madre de citrato de sodio y diluya con agua destilada hasta 1 vez para su uso. Caliéntelo en un autoclave durante 2 min, luego coloque las rodajas en el autoclave, asegurándose de que el nivel del líquido supere el nivel de las rodajas. Caliente a alta temperatura durante 5 minutos, luego deje que los portaobjetos se enfríen naturalmente. Lave las rodajas tres veces con solución de PBS durante 5 minutos cada una. Bloqueo de la peroxidasa endógena: Marque los bordes del tejido en un círculo con una pluma inmunohistoquímica. Incubar las secciones en una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 min en RT, protegidas de la luz, y lavar las secciones tres veces con solución de PBS durante 5 min cada vez. Bloqueo del suero: Bloquee las secciones dejando caer un 10% de suero de cabra en las secciones de tejido marcadas durante 30 min en RT. Asegúrese de que las secciones estén cubiertas uniformemente con la mancha. Incubación de anticuerpos primarios: Agite suavemente la solución de bloqueo y agregue una proporción del anticuerpo primario preparado (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) a la sección. Coloque la sección plana en una caja húmeda e incube durante la noche a 4 °C.NOTA: Agregue una pequeña cantidad de agua a la caja húmeda para evitar la evaporación del anticuerpo. Incubación secundaria de anticuerpos: Lave las secciones tres veces con solución de PBS durante 5 minutos cada vez. Retire el PBS agitando las secciones para secarlas, cubra el tejido con una gota de anticuerpo secundario (marcado HRP) de las especies relacionadas con el anticuerpo primario e incube en RT durante 50 min. Homogeneización de 3,3′-diaminobenzidina (DAB): Lavar las secciones con solución de PBS tres veces durante 5 min cada una. Después de agitar las secciones para secarlas, deje caer la solución cromogénica DAB recién preparada sobre las secciones. Observe el tiempo de desarrollo del color bajo el microscopio; El positivo es de color amarillo parduzco. Enjuague con agua del grifo para terminar el desarrollo del color. Núcleos de tinción: Vuelva a tintar con hematoxilina durante aproximadamente 1 minuto, lave con agua del grifo y luego enjuague durante 10 minutos con agua del grifo para que vuelva a azul. Deshidratación y sellado:Coloque las secciones en alcohol al 75% durante 5 min y al 85% de alcohol durante 5 min. Coloque las secciones en etanol anhidro I durante 5 min, etanol anhidro II durante 5 min y etanol anhidro III durante 5 min. Lavar las secciones en xileno I durante 5 min, sacarlas para que se sequen ligeramente y sellar las secciones con goma neutra. Adquisición de imágenes: Recopile imágenes mediante examen microscópico y analícelas mediante software de halo para el análisis de imágenes panorámicas del tejido.NOTA: Los núcleos teñidos con hematoxilina son azules y la expresión positiva de DAB se observa como amarillo parduzco. 4. Inmunofluorescencia renal de IgA Prepare secciones de parafina para los riñones como se describe en el paso 2.1. Secciones de parafina desparafina:Coloque las secciones en xileno I durante 5 minutos, xileno II durante 5 minutos y xileno III durante 5 minutos. Trate las secciones en etanol anhidro I, etanol anhidro II, 95% de etanol, 90% de etanol, 80% de etanol, 70% de etanol y 50% de etanol, cada una durante 5 min, y lávelas con agua destilada. Recuperación de proteinasa K: Agite las secciones para secarlas y dibuje un círculo alrededor de la sección de tejido con una pluma histoquímica. Añadir la solución de trabajo de proteinasa K (proporción 1:9 de solución madre y PBS) gota a gota para cubrir el tejido e incubar a 37 °C durante 30 min. Lave las secciones tres veces con PBS durante 5 minutos cada una. Penetración en la membrana celular: Agitar ligeramente las secciones para secarlas y luego cubrirlas con Triton al 0,1%. Incubar durante 20 min en RT y lavar las secciones tres veces con PBS durante 5 min cada una. Bloqueo: Añadir un 10% de suero de cabra gota a gota para cubrir el tejido de manera uniforme para el bloqueo en RT durante 30 min. Incubación primaria de anticuerpos: Añadir una cantidad adecuada de anticuerpo IgA conjugado AF488-conjugado de ratón de cabra (1:500) gota a gota para cubrir el tejido de manera uniforme e incubar durante la noche a 4 °C. Núcleos de tinción: Lave las rodajas tres veces con PBS durante 5 minutos cada una. Después de retirar el PBS, añadir la tinción de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) gota a gota en las secciones e incubar durante 15 min a RT, protegido de la luz. Lave y selle las secciones: Lave las secciones tres veces con PBS durante 5 minutos, luego séllelas con un medio de montaje antidecoloración. Microscopía y fotografía: Observe las secciones bajo un microscopio fluorescente y tome imágenes.NOTA: Para DAPI, la excitación ultravioleta es de longitud de onda de 330-380 nm, y la longitud de onda de emisión es de 420 nm, luz azul. La longitud de onda de excitación del isotiocianato de fluoresceína (FITC) es de 465-495 nm y la longitud de onda de emisión es de 515-555 nm, luz verde. 5. Cultivo celular Obtención de la línea de linfocitos B humanos DAKIKI de ATCC, EE. UU. Cultivo de células DAKIKI en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Cultivar las células en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2 y subcultivarlas cada 2-3 días. Utilice células en la fase de crecimiento logarítmico para todos los experimentos. Al 70%-80% de confluencia, recoja las células con una pipeta estéril y centrifugue las células a 140 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender con el medio sin suero y, después de 24 h, deje todas las células en un período de reposo para el tratamiento posterior. 6. Ensayos de citotoxicidad de LDH para el cribado de concentraciones seguras de DIO en células DAKIKI normales Siembre las células DAKIKI en placas de 96 pocillos a una densidad de 4×105 células/pocillo y establezca un grupo de control bajo, un grupo de control alto y diferentes concentraciones de DIO (0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 μg/mL). Incubar en incubadora al 5% de CO2, a 37 °C durante 24 h después del tratamiento correspondiente según el método de agrupamiento. De acuerdo con las instrucciones del kit de detección de citotoxicidad, agregue 5 μL de lisado por pocillo en el grupo de control alto y luego coloque la placa en una incubadora de CO2 al 5%, a 37 °C durante 15 min. Saque la placa, agregue 100 μL de la mezcla de reacción a cada pocillo, incube en la oscuridad durante 10 minutos en RT y luego agregue 50 μL de la solución de reacción de parada. Mida el valor de diámetro exterior a 490 nm en el lector de microplacas lo antes posible. Calcule la tasa de liberación de LDH de diferentes concentraciones de DIO y ≤10% como la dosis máxima administrada según la fórmula: tasa de liberación de LDH = (LDH de pozo experimental – LDH de control bajo) / (LDH de control alto – LDH de control bajo) x 100%. 7. Ensayo CCK-8 para detectar el efecto de DIO en la proliferación de células DAKIKI Con base en los resultados de nuestros experimentos previos20, establecer un modelo de IgAN utilizando LPS 40 μg/mL para inducir células DAKIKI. A continuación, siembre 4×105 células/pocillo en placas de 96 pocillos y divídalo en los grupos de control, modelo y DIO de baja, media y alta concentración (0,25 μg/mL, 0,5 μg/mL y 1,0 μg/mL). Incubar las placas en una incubadora de 5% CO2, 37 °C durante 24 h. A continuación, añada 20 μL de reactivo CCK-8 a cada pocillo y vuelva a colocar las placas en la incubadora (5% CO2, 37 °C) durante 2 h. Después de la incubación, detecte el diámetro exterior a una longitud de onda de 450 nm en el lector de microplacas lo antes posible. 8. ELISA para detectar el efecto de DIO en la secreción de IgA y Gd-IgA1 por las células DAKIKI Siembre las células DAKIKI en placas de 6 pocillos a una densidad de 6×106 células/pocillo, y agrupe y trate las células de acuerdo con el paso 7.2. Cultivar las células durante 24 h, luego centrifugar a 850 x g durante 10 min a 4 °C para obtener el sobrenadante. Detecte las concentraciones de IgA y Gd-IgA1 de acuerdo con las instrucciones del kit. 9.qRT-PCR para detectar el efecto de DIO en los niveles de ARNm de C1GALT1 y Cosmc en células DAKIKI Siembre las células DAKIKI a una densidad de 6×106 células/pocillo en una placa de 6 pocillos, agrupe y trate las células como CCK8 mencionadas en el paso 7.2, e incube durante 24 h. Extraiga el ARN total de las células DAKIKI de acuerdo con las instrucciones del kit de extracción de ARN total. Después de tomar 1 μL de ARN extraído de cada grupo de muestras y medir su concentración, transcriba inversamente 1 μg de ARN total de cada muestra en ADNc de acuerdo con las instrucciones del kit. A continuación, realice la amplificación por RT-PCR para detectar la expresión de cada gen (95 °C durante 15 min, 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s). Calcular el nivel de expresión de cada gen utilizando el método 2-ΔΔCT con β-actina como referencia interna.NOTA: Las secuencias de cebadores fueron las siguientes:C1GALT1: 5′-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3′, 5′-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3′;Cosmc: 5′-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3′, 5′-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3′;β-actina: 5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′, 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′. 10. Western blot para examinar el efecto de DIO en la expresión de las proteínas C1GALT1 y Cosmc en células DAKIKI Siembre las células DAKIKI a una densidad de 6×106 células/pocillo en una placa de 6 pocillos. Agrúpalos y trátalos como se menciona en el paso 7.2. Después de 24 h de incubación, recoja cada grupo de células. Añadir una cantidad adecuada de solución de lisis celular (PMSF: inhibidor de la fosfatasa: solución de lisis RIPA = 1:1:100) e incubar en hielo durante 30 min. A continuación, centrifugar a 13.500 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Determine la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de concentración de proteínas BCA. Mezcle las muestras de proteínas con tampón de carga SDS-PAGE 5x a 4:1 mediante vórtice y caliente las muestras mezcladas a 100 °C durante 5 minutos para desnaturalizar la proteína. Para detectar proteínas con diferentes pesos moleculares, agregue el marcador de proteínas (5 μL/pocillo) y las muestras (20 μg/pocillo) en diferentes carriles de un gel SDS-PAGE al 12%, ejecute la electroforesis SDS-PAGE y transfiera el gel a las membranas de PVDF. Bloquear las membranas con leche descremada al 5% durante 2 h en RT e incubar con los anticuerpos primarios correspondientes (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) durante 24 h. Utilice el anticuerpo β-actina (1:100000) como control interno. Lave la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) con 1x solución salina tamponada Tris, detergente Tween 20 al 0,1% (TBST) tres veces (10 min/tiempo), luego incube con el correspondiente anticuerpo IgG secundario anti-conejo de cabra (1: 10000) a RT durante 2 h. Lave la membrana con TBST nuevamente (tres veces durante 10 minutos cada una) y trátela con una cantidad adecuada de solución de trabajo de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (según las instrucciones del fabricante) para la detección de bandas de proteínas. Capture las imágenes utilizando el sistema de imágenes de quimioluminiscencia y realice un análisis semicuantitativo de los valores de gris de las proteínas utilizando el sistema de análisis de imágenes Image J. 11 de la Constitución. Análisis estadístico Utilice una aplicación de software adecuada para analizar los datos. Extraiga todos los datos como media ± SD (desviación estándar) y evalúe múltiples muestras mediante una prueba de ANOVA de un factor para la comparación entre grupos.NOTA: Para el análisis estadístico se utilizó el software estadístico SPSS 26.0. Se utilizó el método LSD para las comparaciones bidireccionales entre los grupos cuando las varianzas eran iguales, y el método T3 de Dunnett para las comparaciones bidireccionales entre los grupos cuando las varianzas no eran iguales. Se consideró que P<0,05 indicaba una diferencia estadísticamente significativa.