Alívio da nefropatia por IgA mediada por dioscina, inibindo a ativação de células B in vivo e diminuindo a produção de IgA1 deficiente em galactose in vitro

O comitê de ética do Hospital de Guanganmen aprovou este experimento (número de aprovação ética do experimento com animais: IACUC-GAMH-2023-003). 1. Preparando camundongos para o procedimento experimental Crie 22 camundongos Balb/c machos de grau SPF (6-7 semanas de idade, peso corporal 20-25 g) nas instalações de animais do hospital/centro de pesquisa. Divida os animais em grupos controle (n = 8) e modelo (n = 14) usando o método da tabela de números aleatórios. Após 1 semana de criação adaptativa na gaiola de laboratório, alimentar o grupo modelo (grupo) com solução de gamaglobulina bovina (BGG) a 0,1% em água acidificada contendo 6 mmol/L de HCl por 9 semanas de acordo com o protocolo de modelagem de Zou et al.18. Injete 0,1 mL de solução de BGG a 0,1% em solução salina na veia da cauda por 3 dias consecutivos, continuando a beber a solução de BGG para preparar um modelo de camundongo experimental de NIgA18. Deixe o grupo controle beber livremente 6 mmol/L de água acidificada com HCl sem BGG por 9 semanas. Injete o volume correspondente de solução salina na veia da cauda por 3 dias consecutivos.NOTA: Os grupos controle e modelo foram alimentados com a mesma qualidade da ração normal. Após a injeção na veia da cauda, selecione 2 camundongos no grupo controle e 2 camundongos no grupo modelo aleatoriamente e examine-os por proteinúria, microscopia óptica e imunofluorescência para determinar se a modelagem foi bem-sucedida.NOTA: Nenhum alimento é fornecido aos animais, mas eles não são proibidos de entrar na água; Registre a produção de urina. Colete urina por 24 h por gaiolas metabólicas e centrifugue-a a 400 x g por 5 min; descarte o sedimento da urina. Após uma diluição de 10 vezes do sobrenadante, medir a concentração de proteinúria utilizando um kit de ensaio de proteínas urinárias e, em seguida, multiplicar pelo fator de diluição e volume de urina para obter 24 h de proteína total na urina.NOTA: Os métodos de microscopia e imunofluorescência são mostrados nas seções 3 e 4, respectivamente. Depois de preparar o modelo com sucesso, divida 12 camundongos no grupo modelo em 6 camundongos, cada um no grupo modelo (grupo NIgA) e no grupo gavagem DIO (grupo DIO), de acordo com o método da tabela de números aleatórios. Deixar o grupo controle continuar a beber água acidificada com HCl 6 mmol/L sem BGG, e o grupo modelo solução de BGG a 0,1% composta por água acidificada contendo HCl 6 mmol/L. Calcular a dose de administração de gavagem do grupo DIO de acordo com a fórmula de conversão de dose da metodologia experimental farmacológica (convertida de acordo com a massa corporal humana de 70 kg)19. Gavagem DIO comprimidos 0,06 g/kg uma vez por dia durante 8 semanas. Após 8 semanas de gavagem, anestesiar os camundongos por via intraperitoneal com pentobarbital sódico a 0,4% (60 mg/kg) e, após confirmar a anestesia adequada por pinça do dedo do pé, isolar os rins e o adesivo de Peyer para posterior microscopia de luz e análises imuno-histoquímicas.NOTA: O esquema para o modelo in vivo está na Figura Suplementar 1. 2. Análise histológica Seções de parafina para rins e adesivo de PeyerFixe tecidos renais de 3 mm de espessura ou 1 adesivo de Peyer com paraformaldeído a 4% por 24 h, desidrate com etanol gradiente e xileno. Mergulhe em cera por 2 h, sele e congele. Corte cortes renais de 2 μm de espessura e remendos de Peyer de 4 μm de espessura e espalhe-os em água morna. Retire as fatias desdobradas com uma lâmina de vidro limpa e leve ao forno a temperatura constante a 40 °C durante 1 h. Comece a coloração após o pré-processamento da amostra.NOTA: Pegue a superfície coronal da parte hilar do rim, com uma espessura de bloco de tecido de 3 mm. Desparafine e manche as seções de parafina à temperatura ambiente (RT) por 10 min com solução ácida periódica, evitando a luz. Enxágüe com água destilada e limpe a seco com solução de coloração de Schiff por 20-30 min, evitando a luz. Enxágüe com água destilada até que as seções fiquem vermelhas ao microscópio. Coloque as seções em solução de coloração de hematoxilina, core os núcleos por 3 min (os núcleos muito profundamente corados podem ser divididos por cloridrato de etanol) e enxágue com água corrente até que as lâminas fiquem incolores. Realize a desidratação de rotina com concentrações gradientes de etanol e xileno, sele as seções com goma neutra e observe ao microscópio. PAS-positivo é vermelho e o núcleo é azul. 3. Análise imuno-histoquímica do adesivo de Peyer Prepare seções de parafina do adesivo de Peyer conforme descrito na etapa 2.1.NOTA: A espessura das seções para imuno-histoquímica e subsequente imunofluorescência é de 4 μm. Desparafinar as seções de parafina:Coloque as seções em xileno I por 5 min, xileno II por 5 min e xileno III por 5 min. Além disso, enxágue as lâminas em etanol anidro I por 5 min, etanol anidro II por 5 min, álcool 85% por 5 min, álcool 75% por 5 min. Em seguida, enxágue as lâminas em água destilada. Recuperação de antígenoPrepare 50x solução estoque de citrato de sódio e dilua com água destilada para 1x para uso. Aqueça em autoclave por 2 min, depois coloque as fatias na autoclave, garantindo que o nível do líquido ultrapasse o nível das fatias. Aqueça em alta temperatura por 5 min e deixe as lâminas esfriarem naturalmente. Lave as fatias três vezes com a solução PBS por 5 min cada. Bloqueio da peroxidase endógena: Marque as bordas do tecido em um círculo com uma caneta imuno-histoquímica. Incubar as seções em solução de peróxido de hidrogênio a 3% por 15 min em RT, protegida da luz, e lave as seções três vezes com solução de PBS por 5 min de cada vez. Bloqueio de soro: Bloqueie as seções colocando 10% de soro de cabra nas seções de tecido marcadas por 30 min em RT. Certifique-se de que as seções estejam uniformemente cobertas com a mancha. Incubação de anticorpos primários: Sacuda suavemente a solução de bloqueio e adicione uma proporção do anticorpo primário preparado (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) à seção. Colocar a secção numa caixa húmida e incubar durante a noite a 4 °C.NOTA: Adicione uma pequena quantidade de água à caixa molhada para evitar a evaporação do anticorpo. Incubação de anticorpos secundários: Lave as seções três vezes com solução de PBS por 5 minutos de cada vez. Remova o PBS sacudindo as seções secas, cubra o tecido com uma gota de anticorpo secundário (marcador HRP) das espécies relacionadas do anticorpo primário e incube em RT por 50 min. Homogeneização de 3,3′-diaminobenzidina (DAB): Lave as seções com solução de PBS três vezes por 5 min cada. Depois de sacudir as secas secas, coloque a solução cromogénica DAB recém-preparada sobre as secções. Observe o tempo de desenvolvimento da cor ao microscópio; o positivo é amarelo-acastanhado. Enxágue com água da torneira para interromper o desenvolvimento da cor. Núcleos de coloração: Coloração novamente com hematoxilina por cerca de 1 min, lave com água da torneira e depois enxágue por 10 min com água da torneira para voltar ao azul. Desidratação e vedação:Coloque as seções em álcool 75% por 5 min e álcool 85% por 5 min. Coloque as seções em etanol anidro I por 5 min, etanol anidro II por 5 min e etanol anidro III por 5 min. Lave as seções em xileno I por 5 min, retire-as para secar um pouco e sele as seções com goma neutra. Aquisição de imagens: Colete imagens por exame microscópico e analise por software halo para análise panorâmica de imagens do tecido.NOTA: Os núcleos corados com hematoxilina são azuis e a expressão positiva de DAB é observada como amarelo-acastanhada. 4. Imunofluorescência renal de IgA Prepare seções de parafina para os rins conforme descrito na etapa 2.1. Desparafinar seções de parafina:Coloque as seções em xileno I por 5 min, xileno II por 5 min e xileno III por 5 min. Trate as seções em etanol anidro I, etanol anidro II, etanol 95%, etanol 90%, etanol 80%, etanol 70% e etanol 50%, cada um por 5 min, e lave com água destilada. Recuperação da proteinase K: Agite as seções secas e desenhe um círculo ao redor da seção de tecido com uma caneta histoquímica. Adicione a solução de trabalho de proteinase K (proporção de 1:9 de solução estoque e PBS) gota a gota para cobrir o tecido e incube a 37 °C por 30 min. Lave as seções três vezes com PBS por 5 min cada. Penetrar na membrana celular: Agite ligeiramente as seções secas e cubra-as com 0,1% de Tritão. Incube por 20 min em RT e lave as seções três vezes com PBS por 5 min cada. Bloqueio: Adicione 10% de soro de cabra gota a gota para cobrir o tecido uniformemente para bloquear em RT por 30 min. Incubação de anticorpos primários: Adicionar uma quantidade adequada de anticorpo IgA conjugado com AF488 de cabra (1:500) gota a gota para cobrir o tecido uniformemente e incubar durante a noite a 4 °C. Núcleos de coloração: Lave as fatias três vezes com PBS por 5 min cada. Depois de remover o PBS, adicione a coloração de 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) gota a gota nas seções e incube por 15 min em RT, protegido da luz. Lave e sele as seções: Lave as seções três vezes com PBS por 5 min e, em seguida, sele-as com um meio de montagem antidesbotamento. Microscopia e fotografia: Observe as seções sob um microscópio fluorescente e tire fotos.NOTA: Para DAPI, a excitação ultravioleta é o comprimento de onda 330-380 nm e o comprimento de onda de emissão é 420 nm, luz azul. O comprimento de onda de excitação do isotiocianato de fluoresceína (FITC) é de 465-495 nm, e o comprimento de onda de emissão é de 515-555 nm, luz verde. 5. Cultura de células Obtenha a linha de linfócitos B humanos DAKIKI da ATCC, EUA. Cultura de células DAKIKI em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Cultive as células em uma incubadora de CO2 a 37 °C, 5% e subcultive-as a cada 2-3 dias. Use células na fase de crescimento logarítmico para todos os experimentos. Na confluência de 70% a 80%, colete as células com uma pipeta estéril e centrifugue as células a 140 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante, ressuspenda com o meio sem soro e, após 24 h, deixe todas as células em um período quiescente para tratamento subsequente. 6. Ensaios de citotoxicidade de LDH para triagem de concentrações seguras de DIO em células DAKIKI normais Semear células DAKIKI em placas de 96 poços a uma densidade de 4×105 células/poço e configurar um grupo de controle baixo, um grupo de controle alto e diferentes concentrações de DIO (0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 μg/mL). Incubar em incubadora de CO2 a 5%, 37 °C por 24 h após o tratamento correspondente de acordo com o método de agrupamento. De acordo com as instruções do kit de detecção de citotoxicidade, adicione 5 μL de lisado por poço no grupo de controle alto e, em seguida, coloque a placa em uma incubadora de CO2 a 5%, 37 ° C por 15 min. Retire a placa, adicione 100 μL da mistura de reação a cada poço, incube no escuro por 10 min em RT e, em seguida, adicione 50 μL da solução de reação de parada. Meça o valor OD a 490 nm no leitor de microplacas o mais rápido possível. Calcule a taxa de liberação de LDH de diferentes concentrações de DIO e ≤10% como a dose máxima administrada de acordo com a fórmula: Taxa de liberação de LDH = (LDH de poço experimental – LDH de baixo controle) / (LDH de alto controle – LDH de baixo controle) x 100%. 7. Ensaio CCK-8 para detectar o efeito de DIO na proliferação celular DAKIKI Com base nos resultados de nossos experimentos anteriores20, estabelecer um modelo de NIgA usando LPS 40 μg/mL para induzir células DAKIKI. Em seguida, semeie 4×105 células/poço em placas de 96 poços e divida nos grupos controle, modelo e DIO de baixa, média e alta concentração (0,25 μg/mL, 0,5 μg/mL e 1,0 μg/mL). Incubar as placas em uma incubadora de CO2 a 5% a 37 °C por 24 h. Em seguida, adicione 20 μL de reagente CCK-8 a cada poço e coloque as placas de volta na incubadora (5% CO2, 37 ° C) por 2 h. Após a incubação, detectar o diâmetro externo a um comprimento de onda de 450 nm no leitor de microplacas o mais rapidamente possível. 8. ELISA para detectar o efeito de DIO na secreção de IgA e Gd-IgA1 por células DAKIKI Semeie células DAKIKI em placas de 6 poços a uma densidade de 6×106 células/poço e agrupe e trate as células de acordo com a etapa 7.2. Cultivar as células durante 24 h e, em seguida, centrifugar a 850 x g durante 10 min a 4 °C para obter o sobrenadante. Detecte as concentrações de IgA e Gd-IgA1 de acordo com as instruções do kit. 9. qRT-PCR para detectar o efeito de DIO nos níveis de mRNA de C1GALT1 e Cosmc em células DAKIKI Semeie as células DAKIKI a uma densidade de 6×106 células/poço em uma placa de 6 poços, agrupe e trate as células como CCK8 mencionado na etapa 7.2 e incube por 24 h. Extraia o RNA total das células DAKIKI de acordo com as instruções do kit de extração de RNA total. Depois de tomar 1 μL de RNA extraído de cada grupo de amostras e medir sua concentração, transcreva inversamente 1 μg de RNA total de cada amostra em cDNA de acordo com as instruções do kit. Em seguida, realize a amplificação por RT-PCR para detectar a expressão de cada gene (95 °C por 15 min, 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s). Calcular o nível de expressão de cada gene utilizando o método 2-ΔΔCT com β-actina como referência interna.NOTA: As sequências de primers foram as seguintes:C1GALT1: 5′-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3′, 5′-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3′;Cosmc: 5′-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3′, 5′-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3′;β-actina: 5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′, 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’. 10. Western blotting para examinar o efeito do DIO na expressão das proteínas C1GALT1 e Cosmc em células DAKIKI Semeie as células DAKIKI a uma densidade de 6×106 células/poço em uma placa de 6 poços. Agrupe-os e trate-os conforme mencionado na etapa 7.2. Após 24 h de incubação, recolher cada grupo de células. Adicione uma quantidade apropriada de solução de lise celular (PMSF: inibidor de fosfatase: solução de lise RIPA = 1:1:100) e incube em gelo por 30 min. Em seguida, centrifugar a 13.500 x g durante 10 minutos a 4 °C e recolher o sobrenadante. Determine a concentração de proteína usando o kit de ensaio de concentração de proteína BCA. Misture as amostras de proteína com tampão de carregamento 5x SDS-PAGE a 4: 1 por vórtice e aqueça as amostras misturadas a 100 ° C por 5 min para desnaturar a proteína. Para detectar proteínas com diferentes pesos moleculares, adicione o marcador de proteína (5 μL/poço) e amostras (20 μg/poço) em diferentes pistas de um gel SDS-PAGE a 12%, execute a eletroforese SDS-PAGE e transfira o gel para as membranas de PVDF. Bloqueie as membranas com 5% de leite desnatado por 2 h em RT e incube com os anticorpos primários correspondentes (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) por 24 h. Use o anticorpo β-actina (1:100000) como controle interno. Lave a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com 1x solução salina tamponada com Tris, detergente Tween 20 a 0,1% (TBST) três vezes (10 min/tempo) e, em seguida, incube com o anticorpo IgG anti-coelho de cabra secundário correspondente (1: 10000) em RT por 2 h. Lave a membrana com TBST novamente (três vezes por 10 min cada) e trate-a com uma quantidade adequada de solução de trabalho de quimioluminescência aprimorada (ECL) (de acordo com as instruções do fabricante) para detecção de banda de proteína. Capture as imagens usando o sistema de imagem de quimioluminescência e realize uma análise semiquantitativa dos valores de cinza das proteínas usando o sistema de análise de imagem Image J. 11. Agosto Análise estatística Use um aplicativo de software apropriado para analisar os dados. Expresse todos os dados como a média ± DP (desvio padrão) e avalie várias amostras por um teste ANOVA unidirecional para comparação entre os grupos.NOTA: O software estatístico SPSS 26.0 foi utilizado para análise estatística. O método LSD foi usado para comparações bidirecionais entre os grupos quando as variâncias eram iguais, e o método Dunnett T3 foi usado para comparações bidirecionais entre os grupos quando as variâncias não eram iguais. Considerou-se que o P<0,05 indicava diferença estatisticamente significativa.