Dioscine gemedieerde verlichting van IgA-nefropathie door B-celactivering in vivo te remmen en de galactose-deficiënte IgA1-productie in vitro te verminderen

De ethische commissie van het Guanganmen-ziekenhuis keurde dit experiment goed (ethisch goedkeuringsnummer voor dierproeven: IACUC-GAMH-2023-003). 1. Muizen voorbereiden op de experimentele procedure Kweek 22 mannelijke Balb/c-muizen van SPF-kwaliteit (6-7 weken oud, lichaamsgewicht 20-25 g) in de dierenfaciliteit van het ziekenhuis/onderzoekscentrum. Verdeel de dieren in controlegroepen (n = 8) en modelgroepen (n = 14) met behulp van de methode met willekeurige getallen. Na 1 week adaptieve opfok in de laboratoriumkooi, de modelgroep (IgAN-groep) voeden met 0,1% rundergammaglobuline (BGG) oplossing in aangezuurd water met 6 mmol/L HCl gedurende 9 weken volgens het modelleringsprotocol van Zou et al.18. Injecteer 0,1 ml 0,1% BGG-oplossing in zoutoplossing in de staartader gedurende 3 opeenvolgende dagen terwijl u BGG-oplossing blijft drinken om een IgAN-experimenteel muismodel18 te bereiden. Laat de controlegroep gedurende 9 weken vrijelijk 6 mmol/L HCl aangezuurd water zonder BGG drinken. Injecteer het overeenkomstige volume zoutoplossing in de staartader gedurende 3 opeenvolgende dagen.OPMERKING: De controle- en modelgroepen kregen dezelfde kwaliteit als normaal voer. Selecteer na de injectie van de staartader willekeurig 2 muizen in de controlegroep en 2 muizen in de modelgroep en onderzoek ze door middel van proteïnurie, lichtmicroscopie en immunofluorescentie om te bepalen of de modellering succesvol was.OPMERKING: Er wordt geen voedsel aan de dieren verstrekt, maar het is niet verboden om water te geven; Registreer de urineproductie. Verzamel urine gedurende 24 uur in metabolische kooien en centrifugeer deze gedurende 5 minuten op 400 x g ; Gooi urinebezinksel weg. Meet na een 10-voudige verdunning van het supernatant de proteïnurieconcentratie met behulp van een urine-eiwittestkit en vermenigvuldig deze vervolgens met de verdunningsfactor en het urinevolume om 24 uur totaal urine-eiwit te verkrijgen.OPMERKING: Microscopie- en immunofluorescentiemethoden worden weergegeven in respectievelijk secties 3 en 4. Nadat u het model met succes hebt voorbereid, verdeelt u 12 muizen in de modelgroep in 6 muizen, elk in de modelgroep (IgAN-groep) en de DIO-gavagegroep (DIO-groep), volgens de methode van de willekeurige getallentabel. Laat de controlegroep 6 mmol/L HCl aangezuurd water zonder BGG blijven drinken, en de modelgroep 0,1% BGG-oplossing bestaande uit aangezuurd water met 6 mmol/L HCl. Bereken de dosis van de DIO-groep gavage toediening volgens de dosisconversieformule van de farmacologische experimentele methodologie (omgerekend volgens de menselijke lichaamsgewicht van 70 kg)19. Gavage DIO tabletten 0,06 g/kg eenmaal daags gedurende 8 weken. Verdoof de muizen na 8 weken maagsonde intraperitoneaal met 0,4% pentobarbitalnatrium (60 mg/kg) en isoleer de nieren en de Peyer-pleister na bevestiging van de juiste verdoving door teenknijpen voor daaropvolgende lichtmicroscopie en immunohistochemische analyses.OPMERKING: Het schema voor het in vivo model staat in aanvullende figuur 1. 2. Histologische analyse Paraffinesecties voor nieren en Peyer’s patchFixeer nierweefsel van 3 mm dik of 1 Peyer’s patch met 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, dehydrateer met gradiënt ethanol en xyleen. Dompel 2 uur in was, verzegel en vries in. Snijd niersecties van 2 μm dik en 4 μm dikke Peyer’s patch-secties af en spreid ze uit in warm water. Schep de ongevouwen plakjes op met een schoon glasplaatje en bak ze 1 uur in een oven met constante temperatuur op 40 °C. Begin met kleuren na de voorbewerking van het preparaat.OPMERKING: Neem het coronale oppervlak van het hilarische deel van de nier, met een dikte van 3 mm weefselblok. Ontwax en kleur de paraffinesecties bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 minuten met periodieke zuuroplossing, vermijd licht. Spoel af met gedestilleerd water en veeg drooggekleurd met Schiff’s kleuroplossing gedurende 20-30 minuten, vermijd licht. Spoel af met gedestilleerd water tot de secties rood waren onder de microscoop. Plaats de secties in hematoxylinekleuringsoplossing, kleur de kernen gedurende 3 minuten (te diep gekleurde kernen kunnen worden gedeeld door ethanolhydrochloride) en spoel af met stromend water totdat de objectglaasjes kleurloos zijn. Voer routinematige uitdroging uit met gradiëntconcentraties van ethanol en xyleen, sluit de secties af met neutrale gom en observeer onder een microscoop. PAS-positief is rood en de kern is blauw. 3. Immunohistochemische analyse van de Peyer’s patch Bereid paraffinesecties van de Peyer’s patch voor zoals beschreven in stap 2.1.OPMERKING: De dikte van de secties voor immunohistochemische en daaropvolgende immunofluorescentie is 4 μm. Ontwas de paraffinesecties:Leg de secties 5 minuten in xyleen I, xyleen II gedurende 5 minuten en xyleen III gedurende 5 minuten. Spoel de objectglaasjes verder 5 minuten af in watervrije ethanol I, watervrije ethanol II gedurende 5 minuten, 85% alcohol gedurende 5 minuten, 75% alcohol gedurende 5 minuten. Spoel de objectglaasjes vervolgens af in gedestilleerd water. Ophalen van antigeenBereid 50x bouillonoplossing van natriumcitraat en verdun met gedestilleerd water tot 1x voor gebruik. Verwarm het 2 minuten in een autoclaaf en plaats de plakjes vervolgens in de autoclaaf en zorg ervoor dat het vloeistofniveau hoger is dan het niveau van de plakjes. Verwarm 5 minuten op hoge temperatuur en laat de glaasjes vervolgens op natuurlijke wijze afkoelen. Was de plakjes drie keer met PBS-oplossing gedurende 5 minuten elk. Blokkering van endogene peroxidase: Markeer de randen van het weefsel in een cirkel met een immunohistochemische pen. Incubeer de secties in 3% waterstofperoxide-oplossing gedurende 15 minuten bij RT, beschermd tegen licht, en was de secties drie keer met PBS-oplossing gedurende 5 minuten per keer. Serumblokkering: Blokkeer de secties door 10% geitenserum te druppelen op de weefselsecties die gedurende 30 minuten bij RT zijn gemarkeerd. Zorg ervoor dat de secties gelijkmatig bedekt zijn met de vlek. Incubatie van primaire antilichamen: Schud de blokkeringsoplossing voorzichtig af en voeg een deel van het bereide primaire antilichaam toe (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) naar de sectie. Leg het gedeelte plat in een natte bak en incubeer een nacht bij 4 °C.OPMERKING: Voeg een kleine hoeveelheid water toe aan de natte doos om verdamping van het antilichaam te voorkomen. Incubatie van secundaire antilichamen: Was de secties driemaal met PBS-oplossing gedurende 5 minuten per keer. Verwijder PBS door de secties droog te schudden, bedek het weefsel met een druppel secundair antilichaam (HRP-label) van de verwante soort van het primaire antilichaam en incubeer gedurende 50 minuten bij RT. 3,3′-diaminobenzidine (DAB) homogenisatie: Was de secties driemaal gedurende 5 minuten met PBS-oplossing. Nadat u de secties droog hebt geschud, druppelt u de vers bereide DAB-chromogene oplossing op de secties. Observeer de kleurontwikkelingstijd onder de microscoop; Het positieve is bruingeel. Spoel af met kraanwater om de kleurontwikkeling te beëindigen. Kleuringskernen: Kleuring opnieuw met hematoxyline gedurende ongeveer 1 minuut, wassen met kraanwater en vervolgens 10 minuten spoelen met kraanwater om weer blauw te worden. Uitdroging en afdichting:Leg de secties 5 minuten in 75% alcohol en 5 minuten in 85% alcohol. Leg de secties 5 minuten in watervrije ethanol I, 5 minuten in watervrije ethanol II en 5 minuten in watervrije ethanol III. Was de secties in xyleen I gedurende 5 minuten, haal ze eruit om lichtjes te drogen en sluit de secties af met neutrale gom. Beeldacquisitie: Verzamel afbeeldingen door microscopisch onderzoek en analyseer door halo-software voor panoramische beeldanalyse van het weefsel.OPMERKING: Met hematoxyline gekleurde kernen zijn blauw en DAB-positieve expressie wordt waargenomen als bruingeel. 4. Renale IgA-immunofluorescentie Bereid paraffinesecties voor de nieren voor zoals beschreven in stap 2.1. Dewax paraffine secties:Leg de secties 5 minuten in xyleen I, xyleen II gedurende 5 minuten en xyleen III gedurende 5 minuten. Behandel de secties in watervrije ethanol I, watervrije ethanol II, 95% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol en 50% ethanol, elk gedurende 5 minuten, en was met gedestilleerd water. Proteïnase K ophalen: Schud de secties droog en teken met een histochemische pen een cirkel rond de weefselsectie. Voeg de proteïnase K-werkoplossing (verhouding 1:9 van stockoplossing en PBS) druppelsgewijs toe om het weefsel te bedekken en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. Was de secties drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten. Penetratie van het celmembraan: Schud de secties lichtjes droog en bedek ze vervolgens met 0,1% Triton. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT en was de secties drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten. Blokkeren: Voeg druppelsgewijs 10% geitenserum toe om het weefsel gelijkmatig te bedekken voor blokkering bij RT gedurende 30 minuten. Incubatie van primaire antilichamen: Voeg druppelsgewijs een geschikte hoeveelheid geit-anti-muis AF488-geconjugeerd IgA-antilichaam (1:500) toe om het weefsel gelijkmatig te bedekken en ‘s nachts bij 4 °C te incuberen. Kleuringskernen: Was de plakjes driemaal met PBS gedurende elk 5 minuten. Voeg na het verwijderen van de PBS de 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) vlek druppelsgewijs toe aan de secties en incubeer gedurende 15 minuten bij RT, beschermd tegen licht. Was en verzegel de secties: Was de secties driemaal met PBS gedurende 5 minuten en verzegel ze vervolgens met een antifade-montagemedium. Microscopie en fotografie: Bekijk de secties onder een fluorescerende microscoop en maak foto’s.OPMERKING: Voor DAPI is ultraviolette excitatie een golflengte van 330-380 nm en de emissiegolflengte is 420 nm, blauw licht. De excitatiegolflengte van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) is 465-495 nm en de emissiegolflengte is 515-555 nm, groen licht. 5. Celcultuur Verkrijg de humane B-lymfocytenlijn DAKIKI van ATCC, VS. Kweek DAKIKI-cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Kweek de cellen in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en subcultuur ze elke 2-3 dagen. Gebruik cellen in de logaritmische groeifase voor alle experimenten. Bij 70%-80% confluentie verzamelt u de cellen met een steriele pipet en centrifugeert u de cellen gedurende 5 minuten op 140 x g . Gooi het supernatant weg, resuspendeer met het serumvrije medium en laat na 24 uur alle cellen in een rustperiode voor de volgende behandeling. 6. LDH-cytotoxiciteitstesten voor het screenen van veilige concentraties DIO op normale DAKIKI-cellen Zaad DAKIKI-cellen in platen met 96 putjes met een dichtheid van 4×105 cellen/putje en stel een lage controlegroep in, een hoge controlegroep en verschillende concentraties DIO (0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 μg/ml). Incubeer in een incubator van 5% CO2, 37 °C gedurende 24 uur na de overeenkomstige behandeling volgens de groeperingsmethode. Voeg volgens de instructies van de cytotoxiciteitsdetectiekit 5 μL lysaat per putje toe in de hoge controlegroep en plaats de plaat vervolgens gedurende 15 minuten in een incubator van 5% CO2, 37 °C. Haal de plaat eruit, voeg 100 μL van het reactiemengsel toe aan elk putje, incubeer 10 minuten in het donker bij RT en voeg vervolgens 50 μL van de stopreactieoplossing toe. Meet zo snel mogelijk de OD-waarde bij 490 nm op de microplaatlezer. Bereken de LDH-afgiftesnelheid van verschillende concentraties DIO en ≤10% als de maximale dosis die wordt toegediend volgens de formule: LDH-afgiftesnelheid = (experimentele put LDH – lage controle LDH) / (hoge controle LDH – lage controle LDH) x 100%. 7. CCK-8 test voor het detecteren van het effect van DIO op de proliferatie van DAKIKI-cellen Op basis van de resultaten van onze eerdere experimenten20 een IgAN-model opstellen met LPS 40 μg/ml om DAKIKI-cellen te induceren. Zaai vervolgens 4×105 cellen/putje in platen met 96 putjes en verdeel het in de controle-, model- en DIO-groepen met lage, gemiddelde en hoge concentratie (0.25 μg/ml, 0.5 μg/ml en 1.0 μg/ml). Incubeer de platen gedurende 24 uur in een incubator van 5% CO2, 37 °C. Voeg vervolgens 20 μl CCK-8-reagens toe aan elk putje en plaats de platen gedurende 2 uur terug in de incubator (5% CO2, 37 °C). Detecteer na de incubatie zo snel mogelijk de OD op een golflengte van 450 nm op de microplaatlezer. 8. ELISA voor het detecteren van het effect van DIO op de secretie van IgA en Gd-IgA1 door DAKIKI-cellen Zaad DAKIKI-cellen in platen met 6 putjes met een dichtheid van 6×106 cellen/putje, groepeer en behandel de cellen volgens stap 7.2. Kweek de cellen gedurende 24 uur en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 850 x g bij 4 °C om het supernatans te verkrijgen. Detecteer IgA- en Gd-IgA1-concentraties volgens de instructies van de kit. 9.qRT-PCR voor het detecteren van het effect van DIO op C1GALT1- en Cosmc-mRNA-niveaus in DAKIKI-cellen Zaai de DAKIKI-cellen met een dichtheid van 6×106 cellen/putje in een plaat met 6 putjes, groepeer en behandel de cellen zoals vermeld in stap 7.2, en incubeer gedurende 24 uur. Extraheer totaal RNA uit DAKIKI-cellen volgens de instructies van de totale RNA-extractiekit. Na het nemen van 1 μL geëxtraheerd RNA van elke groep monsters en het meten van de concentratie, transcribeert u omgekeerd 1 μg totaal RNA van elk monster in cDNA volgens de instructies van de kit. Voer vervolgens RT-PCR-amplificatie uit om de expressie van elk gen te detecteren (95 °C gedurende 15 minuten, 95 °C gedurende 10 s en 60 °C gedurende 30 s). Bereken het expressieniveau van elk gen met behulp van de 2-ΔΔCT-methode met β-actine als interne referentie.OPMERKING: De primersequenties waren als volgt:C1GALT1: 5′-AAGGTTGACACCACAGCCTAA-3′, 5′-CTTTGACGTTTTTGGCCTTT-3″;Cosmc: 5′-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3′, 5′-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3′;β-actine: 5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′, 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’. 10. Western blotting voor het onderzoeken van het effect van DIO op de expressie van C1GALT1- en Cosmc-eiwitten in DAKIKI-cellen Zaai de DAKIKI-cellen met een dichtheid van 6×106 cellen/putje in een plaat met 6 putjes. Groepeer en behandel ze zoals vermeld in stap 7.2. Verzamel na 24 uur incubatie elke groep cellen. Voeg een geschikte hoeveelheid cellyse-oplossing toe (PMSF: fosfataseremmer: RIPA lysisoplossing = 1:1:100) en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens bij 13.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en vang het supernatant op. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-eiwitconcentratietestkit. Meng de eiwitmonsters met 5x SDS-PAGE-laadbuffer op 4:1 door middel van vortexen en verwarm de gemengde monsters gedurende 5 minuten op 100 °C om het eiwit te denatureren. Om eiwitten met verschillende molecuulgewichten te detecteren, voegt u de eiwitmarker (5 μl/putje) en monsters (20 μg/putje) toe aan verschillende banen van een 12% SDS-PAGE-gel, voert u SDS-PAGE-elektroforese uit en brengt u de gel over naar PVDF-membranen. Blokkeer de membranen met 5% magere melk gedurende 2 uur bij RT en incubeer met de overeenkomstige primaire antilichamen (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) gedurende 24 uur. Gebruik β-actine-antilichaam (1:100000) als interne controle. Was het polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met 1x Tris-gebufferde zoutoplossing, 0,1% Tween 20 wasmiddel (TBST) driemaal (10 min/tijd) en incubeer vervolgens met het overeenkomstige secundaire geitenanti-konijn IgG-antilichaam (1: 10000) bij RT gedurende 2 uur. Was het membraan opnieuw met TBST (drie keer gedurende 10 minuten elk) en behandel het met een geschikte hoeveelheid verbeterde chemiluminescentie (ECL) werkoplossing (volgens de instructies van de fabrikant) voor detectie van eiwitbanden. Leg de beelden vast met behulp van het chemiluminescentiebeeldvormingssysteem en voer een semi-kwantitatieve analyse uit van de grijswaarden van eiwitten met behulp van het Image J-beeldanalysesysteem. 11. okt. Statistische analyse Gebruik een geschikte softwaretoepassing voor het analyseren van de gegevens. Druk alle gegevens uit als het gemiddelde ± SD (standaarddeviatie) en evalueer meerdere monsters door middel van een eenrichtings-ANOVA-test voor vergelijking tussen groepen.OPMERKING: SPSS statistische software 26.0 werd gebruikt voor statistische analyse. De LSD-methode werd gebruikt voor tweerichtingsvergelijkingen tussen groepen wanneer de varianties gelijk waren, en de Dunnett T3-methode werd gebruikt voor tweerichtingsvergelijkingen tussen groepen wanneer de varianties niet gelijk waren. P<0,05 werd beschouwd als een statistisch significant verschil.