Диосцин опосредует облегчение IgA-нефропатии путем ингибирования активации В-клеток in vivo и снижения продукции IgA1 с дефицитом галактозы in vitro

Комитет по этике больницы Гуанганьмэнь одобрил этот эксперимент (номер этического одобрения эксперимента на животных: IACUC-GAMH-2023-003). 1. Подготовка мышей к экспериментальной процедуре Вырастите 22 самцов мышей Balb/c класса SPF (в возрасте 6-7 недель, масса тела 20-25 г) в животноводческом помещении больницы/исследовательского центра. Разделите животных на контрольную (n = 8) и модельную (n = 14) группы с помощью метода таблицы случайных чисел. После 1 недели адаптивного выращивания в лабораторной клетке в течение 9 недель кормили модельную группу (группу IgAN) 0,1% раствором гамма-глобулина крупного рогатого скота (BGG) в подкисленной воде, содержащей 6 ммоль/л HCl. Вводите 0,1 мл 0,1% раствора BGG в физиологическом растворе в хвостовую вену в течение 3 дней подряд, продолжая пить раствор BGG для приготовления экспериментальной модели мышиIgAN 18. Дайте контрольной группе свободно выпить 6 ммоль/л подкисленной воды HCl без BGG в течение 9 недель. Введите соответствующий объем физиологического раствора в хвостовую вену в течение 3 дней подряд.Примечание: Контрольная и модельная группы получали корм того же качества, что и обычный корм. После инъекции хвостовой вены случайным образом выберите 2 мыши в контрольной группе и 2 мыши в модельной группе и изучите их с помощью протеинурии, световой микроскопии и иммунофлуоресценции, чтобы определить, было ли моделирование успешным.ПРИМЕЧАНИЕ: Животным не предоставляется пища, но и не запрещено пить воду; Запись диуреза. Собирайте мочу в течение 24 ч с помощью метаболических клеток и центрифугируйте ее при 400 х г в течение 5 мин; Сбросить осадок мочи. После 10-кратного разведения надосадочной жидкости измерьте концентрацию протеинурии с помощью набора для анализа белка мочи, а затем умножьте на фактор разведения и объем мочи, чтобы получить 24 часа общего белка мочи.ПРИМЕЧАНИЕ: Методы микроскопии и иммунофлюоресценции показаны в разделах 3 и 4 соответственно. После успешной подготовки модели разделите 12 мышей в модельной группе на 6 мышей, каждая из которых находится в модельной группе (группа IgAN) и группе DIO gavage (группа DIO), в соответствии с методом таблицы случайных чисел. Пусть контрольная группа продолжает пить 6 ммоль/л HCl подкисленной воды без BGG, а модельная группа 0,1% раствор BGG, состоящий из подкисленной воды, содержащей 6 ммоль/л HCl. Рассчитайте дозу введения DIO group gavage в соответствии с формулой пересчета дозы фармакологической экспериментальной методики (в пересчете на массу тела человека 70 кг)19. Gavage DIO таблетки по 0,06 г/кг один раз в сутки в течение 8 недель. После 8 недель зондирования мышам проводят внутрибрюшинную анестезию 0,4% пентобарбитала натрия (60 мг/кг), а после подтверждения надлежащей анестезии путем ущемления пальцев ног изолируют почки и пластырь Пейера для последующей световой микроскопии и иммуногистохимического анализа.ПРИМЕЧАНИЕ: Схема для модели in vivo приведена на дополнительном рисунке 1. 2. Гистологический анализ Парафиновые срезы для почек и пластырь ПейераЗафиксируйте ткани почек толщиной 3 мм или 1 пластырь Пейера 4% параформальдегидом на 24 ч, обезвожьте градиентным этанолом и ксилолом. Опустить в воск на 2 часа, запечатать и заморозить. Вырежьте срезы почек толщиной 2 мкм и срезы пейерова пейера толщиной 4 мкм и разложите их в теплой воде. Зачерпните развернутые ломтики чистым предметным стеклом и запекайте их в духовке постоянной температуры при температуре 40 °C в течение 1 часа. Приступайте к окрашиванию после предварительной обработки образца.ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите коронковую поверхность прикорневой части почки, толщиной 3 мм тканевого блока. Удалите парафин и окрашивайте срезы парафина при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут периодическим раствором кислоты, избегая попадания света. Промойте дистиллированной водой и вытрите насухо испачканные раствором для окрашивания Шиффа в течение 20-30 минут, избегая попадания света. Промойте дистиллированной водой до тех пор, пока срезы не станут красными под микроскопом. Поместите срезы в раствор для окрашивания гематоксилина, закрасьте ядра на 3 мин (ядра, окрашенные слишком глубоко, могут быть разделены гидрохлоридом этанола) и промойте проточной водой до тех пор, пока стекла не станут бесцветными. Проведите рутинное обезвоживание с помощью градиентных концентраций этанола и ксилола, запечатайте срезы нейтральной камедью и наблюдайте под микроскопом. PAS-положительный имеет красный цвет, а ядро – синий. 3. Иммуногистохимический анализ пейерова пластыря Подготовьте парафиновые срезы пластыря Пейера, как описано в шаге 2.1.ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина срезов для иммуногистохимической и последующей иммунофлюоресценции составляет 4 мкм. Депарафинизация срезов:Поместите срезы в ксилол I на 5 мин, ксилол II на 5 мин и ксилол III на 5 мин. Далее промыть предметные стекла в безводном этаноле I в течение 5 мин, безводном этаноле II в течение 5 мин, 85% спирте в течение 5 мин, 75% спирте в течение 5 мин. Затем промойте горки в дистиллированной воде. Забор антигенаПриготовьте 50-кратный исходный раствор цитрата натрия и разбавьте дистиллированной водой до 1-кратного для использования. Нагрейте его в автоклаве в течение 2 минут, после чего поместите ломтики в автоклав, следя за тем, чтобы уровень жидкости превышал уровень ломтиков. Нагрейте при высокой температуре в течение 5 минут, затем дайте предметным стеклам остыть естественным образом. Промойте ломтики трижды раствором PBS по 5 мин каждый. Блокирование эндогенной пероксидазы: Отметьте границы ткани по кругу иммуногистохимической ручкой. Срезы инкубировать в 3% растворе перекиси водорода в течение 15 мин при РТ, защищенном от света, и каждый раз трижды промыть срезы раствором PBS в течение 5 мин. Блокирование сыворотки: Заблокируйте участки, капнув 10% козью сыворотку на участки ткани, помеченные в течение 30 минут при RT. Убедитесь, что участки равномерно покрыты пятном. Инкубация первичных антител: Осторожно стряхните блокирующий раствор и добавьте часть подготовленного первичного антитела (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) в раздел. Поместите секцию в плоскую форму во влажную коробку и выдерживайте в течение ночи при температуре 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте небольшое количество воды во влажную коробку, чтобы предотвратить испарение антител. Инкубация вторичных антител: каждый раз трижды промывайте срезы раствором PBS в течение 5 минут. Удалите PBS, встряхнув срезы насухо, покройте ткань каплей вторичного антитела (HRP-метка) родственных видов первичного антитела и инкубируйте при ЛТ в течение 50 минут. Гомогенизация 3,3′-диаминобензидина (DAB): Промойте срезы раствором PBS трижды в течение 5 мин каждая. Вытряхнув срезы насухо, капните на срезы свежеприготовленный хромогенный раствор DAB. Наблюдать за временем проявления цвета под микроскопом; Позитив – коричневато-желтый. Промойте водопроводной водой, чтобы остановить развитие цвета. Окрашивание ядер: Повторно окрашивайте гематоксилином в течение примерно 1 минуты, промойте водой из-под крана, а затем прополощите в течение 10 минут водопроводной водой, чтобы вернуть синий цвет. Обезвоживание и герметизация:Поместите срезы в 75% спирт на 5 мин и 85% спирт на 5 мин. Поместите секции в безводный этанол I на 5 минут, безводный этанол II на 5 минут и безводный этанол III на 5 минут. Промойте секции в ксилоле I в течение 5 минут, выньте их для небольшого подсыхания и заклейте секции нейтральной резинкой. Получение изображений: Собирайте изображения с помощью микроскопического исследования и анализируйте с помощью программного обеспечения гало для анализа панорамных изображений ткани.Примечание: Окрашенные гематоксилином ядра имеют синий цвет, а положительная экспрессия DAB наблюдается как коричневато-желтая. 4. Почечная иммунофлюоресценция IgA Подготовьте парафиновые срезы для почек, как описано в шаге 2.1. Парафиновые срезы для депарафина:Поместите срезы в ксилол I на 5 мин, ксилол II на 5 мин и ксилол III на 5 мин. Обработайте срезы безводным этанолом I, безводным этанолом II, 95% этанолом, 90% этанолом, 80% этанолом, 70% этанолом и 50% этанолом в течение 5 минут и промойте дистиллированной водой. Извлечение протеиназы К: Вытряхните срезы насухо и нарисуйте круг вокруг участка ткани с помощью гистохимического ручки. Добавьте рабочий раствор протеиназы К (соотношение 1:9 стокового раствора и PBS) по каплям, чтобы покрыть ткань, и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. Промойте секции три раза PBS по 5 минут каждая. Проникновение в клеточную мембрану: Слегка встряхните срезы насухо, а затем покройте их 0,1% Тритоном. Инкубировать в течение 20 минут при RT и трижды промыть секции PBS по 5 минут каждая. Блокирование: Добавьте 10% козью сыворотку по каплям, чтобы равномерно покрыть ткань для блокировки при RT в течение 30 минут. Первичная инкубация антител: Добавьте соответствующее количество козьего антитела IgA против мыши AF488 (1:500) по каплям, чтобы равномерно покрыть ткань, и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Окрашивание ядер: Промойте ломтики трижды PBS в течение 5 минут каждый. После удаления PBS добавьте по каплям краситель 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) на срезы и выдерживайте в течение 15 минут при RT в защищенном от света месте. Промойте и загерметизируйте секции: Промойте секции трижды PBS в течение 5 минут, затем загерметизируйте их монтажной средой, препятствующей выцветанию. Микроскопия и фотография: Наблюдайте за срезами под флуоресцентным микроскопом и делайте снимки.ПРИМЕЧАНИЕ: Для DAPI ультрафиолетовое возбуждение имеет длину волны 330-380 нм, а длина волны излучения составляет 420 нм, синий свет. Длина волны возбуждения флуоресцеина изотиоцианата (FITC) составляет 465-495 нм, а длина волны излучения – 515-555 нм, зеленый свет. 5. Культура клеток Получите линию В-лимфоцитов человека DAKIKI от ATCC, США. Культуру клеток DAKIKI в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина. Культивируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 и подкультивируйте их каждые 2-3 дня. Для всех экспериментов используйте клетки в логарифмической фазе роста. При конфлюенции 70%-80% соберите клетки с помощью стерильной пипетки и центрифугируйте клетки при давлении 140 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость, восстановите суспендию с помощью среды, не содержащей сыворотки, и через 24 ч оставьте все клетки в состоянии покоя для последующего лечения. 6. Анализ цитотоксичности ЛДГ для скрининга безопасных концентраций ДИО на нормальных клетках DAKIKI Засейте клетки DAKIKI в 96-луночные планшеты с плотностью 4×105 клеток/лунку и выделите группу Low control, группу High control и различные концентрации DIO (0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 мкг/мл). Инкубировать в инкубаторе с концентрацией 5%СО2, 37 °С в течение 24 ч после соответствующей обработки по методу группировки. В соответствии с инструкцией набора для определения цитотоксичности добавьте 5 мкл лизата на лунку в группе с высоким уровнем контроля, а затем поместите планшет в инкубатор с 5% содержаниемCO2, 37 °C на 15 минут. Достаньте тарелку, добавьте в каждую лунку по 100 мкл реакционной смеси, выдержите в темноте 10 мин при RT, а затем добавьте 50 мкл раствора для остановки реакции. Как можно скорее измерьте значение наружного диаметра на длине волны 490 нм на считывателе микропланшетов. Рассчитайте скорость высвобождения ЛДГ различных концентраций ДИО и ≤10% в качестве максимальной введенной дозы по формуле: скорость высвобождения ЛДГ = (экспериментальная скважина ЛДГ – низкий контроль ЛДГ) / (высокий контроль ЛДГ – низкий контроль ЛДГ) х 100%. 7. Анализ CCK-8 для определения влияния DIO на пролиферацию клеток DAKIKI Основываясь на результатах наших предыдущих экспериментов20, создать модель IgAN с использованием ЛПС 40 мкг/мл для индуцирования клеток DAKIKI. Затем засейте 4×105 клеток/лунку в 96-луночные планшеты и разделите на контрольную, модельную и DIO группы низкой, средней и высокой концентрации (0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл и 1,0 мкг/мл). Инкубировать планшеты в инкубаторе с 5% CO2, 37 °C в течение 24 часов. Затем добавьте по 20 мкл реагента CCK-8 в каждую лунку и поместите планшеты обратно в инкубатор (5% CO2, 37 °C) на 2 ч. После инкубации как можно скорее определите наружный диаметр на длине волны 450 нм на микропланшетном риддере. 8. ИФА для определения влияния ДИО на секрецию IgA и Gd-IgA1 клетками DAKIKI Засейте клетки DAKIKI в 6-луночные планшеты с плотностью 6×106 клеток/лунку, сгруппируйте и обработайте клетки в соответствии с шагом 7.2. Культивируйте клетки в течение 24 ч, затем центрифугируйте при 850 x g в течение 10 мин при 4 °C для получения надосадочной жидкости. Определите концентрации IgA и Gd-IgA1 в соответствии с инструкцией к набору. 9. qRT-ПЦР для определения влияния DIO на уровни мРНК C1GALT1 и Cosmc в клетках DAKIKI Засейте клетки DAKIKI в плотности 6×106 клеток/лунку в 6-луночный планшет, сгруппируйте и обработайте клетки в соответствии с CCK8, упомянутым на шаге 7.2, и инкубируйте в течение 24 часов. Извлеките общую РНК из клеток DAKIKI в соответствии с инструкциями набора для экстракции общей РНК. После взятия 1 мкл экстрагированной РНК из каждой группы образцов и измерения ее концентрации обратное расшифровка 1 г общей РНК из каждого образца в кДНК в соответствии с инструкциями к набору. Затем проводят амплификацию ОТ-ПЦР для определения экспрессии каждого гена (95 °C в течение 15 мин, 95 °C в течение 10 с и 60 °C в течение 30 с). Рассчитайте уровень экспрессии каждого гена с помощью метода 2-ΔΔCT с β-актином в качестве внутреннего эталона.ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров были следующими:C1GALT1: 5′-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3′, 5′-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3′;Cosmc: 5′-GCTCCTTTTTGAAGGGTG-3′, 5′-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3′;β-актин: 5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′, 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′. 10. Вестерн-блоттинг для изучения влияния DIO на экспрессию белков C1GALT1 и Cosmc в клетках DAKIKI Засейте клетки DAKIKI с плотностью 6×106 клеток/лунку в 6-луночный планшет. Сгруппируйте и обрабатывайте их, как указано в шаге 7.2. Через 24 ч инкубации соберите каждую группу клеток. Добавьте соответствующее количество раствора для лизиса клеток (PMSF: ингибитор фосфатазы: раствор для лизиса RIPA = 1:1:100) и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируйте при 13 500 x g в течение 10 минут при 4 °C и соберите надосадочную жидкость. Определите концентрацию белка с помощью набора для анализа концентрации белка BCA. Смешайте образцы белка с 5-кратным загрузочным буфером SDS-PAGE в соотношении 4:1 путем вортексирования и нагрейте смешанные образцы до 100 °C в течение 5 минут для денатурации белка. Чтобы обнаружить белки с различной молекулярной массой, добавьте маркер белка (5 мкл/лунку) и образцы (20 мкг/лунку) в разные полосы 12% геля SDS-PAGE, запустите электрофорез SDS-PAGE и перенесите гель на мембраны PVDF. Блокируйте мембраны 5% обезжиренным молоком в течение 2 ч при ЛТ и инкубируйте с соответствующими первичными антителами (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) в течение 24 ч. Используйте антитела к β-актину (1:100000) в качестве внутреннего контроля. Промойте мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) 1x трис-буферизованным физиологическим раствором, 0,1% детергентом Tween 20 (TBST) три раза (10 мин/раз), затем инкубируйте с соответствующими вторичными антителами IgG козы против кролика (1: 10000) в RT в течение 2 ч. Еще раз промойте мембрану TBST (три раза по 10 мин) и обработайте ее соответствующим количеством рабочего раствора с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (в соответствии с инструкциями производителя) для обнаружения белковой полосы. Получение изображений с помощью системы хемилюминесцентной визуализации и выполнение полуколичественного анализа значений серого цвета белков с помощью системы анализа изображений Image J. 11. Статистический анализ Используйте соответствующее программное приложение для анализа данных. Выразите все данные в виде среднего ± SD (стандартное отклонение) и оцените несколько образцов с помощью одностороннего теста ANOVA для сравнения между группами.ПРИМЕЧАНИЕ: Для статистического анализа использовалось статистическое программное обеспечение SPSS 26.0. Метод ЛСД использовался для двустороннего сравнения между группами, когда дисперсии были равны, а метод Даннетта Т3 использовался для двустороннего сравнения между группами, когда дисперсии не были равны. Считалось, что P<0,05 указывает на статистически значимую разницу.