تخفيف اعتلال الكلية IgA بوساطة الديوسين عن طريق تثبيط تنشيط الخلايا البائية في الجسم الحي وتقليل إنتاج IgA1 الذي يعاني من نقص الجالاكتوز في المختبر
Summary
توفر هذه الدراسة بيانات تجريبية لعلاج اعتلال الكلية بالغلوبولين المناعي A (IgAN) باستخدام Dioscin (DIO) ، المكون النشط ل Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) ، ونموذجا لدراسة تأثيرات الأدوية العشبية والآليات الأساسية في الجسم الحي وفي المختبر.
Abstract
تحدث الزيادة في IgA1 (Gd-IgA1) الذي يعاني من نقص الجالاكتوز المنتشر بسبب التنشيط المفرط للخلايا الإفرازية الإيجابية IgA في عملية الاستجابات المناعية المخاطية ، وهو رابط مهم في التسبب في اعتلال الكلية IgA (IgAN). رقعة باير، المكان البارز الذي تتحول فيه الخلايا الليمفاوية البائية إلى خلايا بلازمية تفرز IgA، هي المصدر الرئيسي للغلوبولين المناعي A. بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط التعبير السفلي للنواة 1β-1،3-galactosyltransferase (C1GalT1) ومرافقه الجزيئي ، المرافق الجزيئي الخاص ب C1GalT1 (Cosmc) ، بالجليكوزيل غير الطبيعي ل IgA1 في مرضى IgAN. تظهر تجربتنا السريرية أن الأدوية العشبية Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) يمكن أن تخفف من البيلة البروتينية والبيلة الدموية وتحسن وظائف الكلى لدى مرضى IgAN. Dioscin (DIO) هو أحد المكونات النشطة الرئيسية ل DNR ، والتي لديها أنشطة دوائية مختلفة. تستكشف هذه الدراسة آلية DIO المحتملة في علاج IgAN.تم إنشاء فأر نموذج IgAN عن طريق الحث المناعي المخاطي. تم تقسيم الفئران إلى مجموعات التحكم والنموذج و DIO. تم الكشف عن ترسب IgA الكبيبي في الفئران ، والتغيرات المرضية الكلوية ، وعلامات الخلايا البائية CD20 و CXCR5 التعبير في رقعة باير عن طريق التألق المناعي والكيمياء المناعية. بعد تحفيز عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، تمت دراسة تأثيرات DIO على تكاثر خلايا DAKIKI ، وإفراز IgA و Gd-IgA1 ، و C1GalT1 ، وتعبير Cosmc بواسطة اختبار مجموعة عد الخلايا -8 (CCK-8) ، واختبار مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، وتفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي (QRT-PCR) ، والنشاف الغربي (WB). في الدراسات في الجسم الحي ، تم تخفيف ترسب IgA المصحوب بتضخم كبيبي متوسط اللون وزيادة التعبير عن CD20 و CXCR5 في رقعة باير في ماوس نموذج IgAN بواسطة DIO. أظهرت الدراسات في المختبر أن 0.25 ميكروغرام / مل إلى 1.0 ميكروغرام / مل DIO يثبط تكاثر خلايا DAKIKI الناجم عن LPS ، وإفراز IgA و Gd-IgA1 ، وينظم تعبير mRNA والبروتين ل C1GalT1 و Cosmc. توضح هذه الدراسة أن DIO قد يقلل من إنتاج Gd-IgA1 عن طريق تثبيط التنشيط المفرط للخلايا المفرزة ل IgA وتنظيم تعبير C1GALT1 / Cosmc.
Introduction
اعتلال الكلية IgA (IgAN) هو النوع الأكثر شيوعا من التهاب كبيبات الكلى الأولي ، والذي لا يوجد علاج محدد له ، ولا يزال سببا مهما لمرض الكلى في المرحلة النهائية1. على الرغم من أن التسبب في IgAN لا يزال غير مفهوم تماما ، إلا أن “فرضية الضربات المتعددة” مقبولة بشكل عام وتدعمها مجموعة كبيرة من الأدلة البحثية السريرية والتجريبية2. يتضمن التسبب في IgAN تنشيط الخلايا البائية وإنتاج IgA1 (Gd-IgA1) الذي يعاني من نقص الجالاكتوز 3. الزيادة في تعميم Gd-IgA1 بسبب الانتشار المفرط وتنشيط الخلايا التي تفرز IgA أثناء الاستجابة المناعية المخاطية هي رابط حاسم في التسبب في IgAN4،5،6. باعتبارها المكان المركزي لتكاثر وتفعيل تحويل النمط الظاهري للخلايا اللمفاوية B إلى خلايا إفراز IgA ، فإن رقعة باير هي المصدر الرئيسي لإفراز IgA ، وترتبط ارتباطا وثيقا بحدوث وتطور IgAN 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط تكاثر الخلايا المفرزة ل IgA1 ، وكذلك التعبير عن Core 1β-1،3-galactosyltransferase (C1GalT1) و C1GalT1 المرافقة الجزيئية الخاصة (Cosmc) ، بالجليكوزيل غير الطبيعي ل IgA1 ، والذي يسبب إنتاج GD-IgA1 في مرضى IgAN 6,9.
تقدمت الدراسة السريرية على علاج IgAN بالأدوية العشبية في السنوات الأخيرة. Yiqi Qingjie Formula هي صيغة أساسية لعلاج IgAN من قبل قسم أمراض الكلى في مستشفى Guang’anmen. وجدت الدراسة السابقة لمجموعتنا أن Gd-IgA1 انخفض في مصل مرضى IgAN بعد العلاج بصيغة Yiqi Qingjie. باعتبارها واحدة من أكثر الأعشاب استخداما في صيغة Yiqi Qingjie ، فإن Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) هي جذمور مجفف من Dioscorea Nipponica Makino ، والذي له وظائف مختلفة مثل تنظيم المناعة ، وقمع الالتهاب ، وتخفيف السعال والربو10,11. عالج العديد من العلماء IgAN مع DNR وحققوا نتائج جيدة12،13،14. باعتباره العنصر النشط الرئيسي في DNR15 ، يقلل Dioscin (DIO) من حمض اليوريك ، ويمنع التليف ، ويمنع الاستجابة الالتهابية ، والإجهاد المضاد للأكسدة16,17. لذلك ، قد يكون لدى DIO آلية عمل جديدة لمنع الإفراز الخلوي ل Gd-IgA1 المفرط وممارسة تأثيرات محددة لحماية الكلى. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن أي دراسة حول آلية عمل DIO لعلاج IgAN.
لاستكشاف الآلية العلاجية المحتملة ل DIO على IgAN وتوفير طريقة جديدة لعلاج IgAN ، أجرينا تجارب للتأثيرات العلاجية ل DIO على IgAN في الجسم الحي وفي المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
السمة المرضية المميزة ل IgAN هي ترسب المجمعات المناعية المحتوية على IgA1 و GD-IgA1 في المنطقة المتوسطة من الكبيبة21,22. الحد من تكوين المجمعات المناعية يمكن أن يقلل من إصابة الكلى ويخفف من الأعراض السريرية ل IgAN. في تجربة في الجسم الحي ، درسنا الآثار العلاجية ل DIO على IgAN، ووجدنا أن DIO يمكن أن يقلل من ترسب IgA في كلية الفئران النموذجية IgAN. ثبت أن تراكم الخلايا التي تفرز IgA في الكلى يرتبط بالتسبب في IgAN23. كموقع مهم لتكاثر وتنشيط الخلايا الليمفاوية B ، تعد رقعة باير مصدرا مهما للخلايا التي تفرز IgA ، لذلك قمنا بفحص التعبير عن علامات الخلايا الليمفاوية B (CD20 ، CXCR5) في رقعة باير ووجدنا أن DIO يمكن أن يمنع التعبير عن الخلايا الليمفاوية B في رقعة باير لنموذج الفئران IgAN. يمكن أن توفر هذه النتائج التجريبية أساسا لتطبيق DIO في علاج IgAN.
أجرينا التجارب التالية في المختبر لمزيد من التحقيق في آلية عمل DIO على IgAN. أولا ، لقد ثبت سابقا أن DAKIKI ، وهو خط خلايا بائية مخلد EBV يفرز IgA1 ، جزء منه هو GD-IgA124 ، مثالي للبحث في المختبر عن آلية عمل الدواء على IgAN. اخترنا خلايا DAKIKI للتحقيق في الآلية الجزيئية ل DIO في علاج IgAN. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب الاستجابة المناعية الالتهابية المخاطية دورا أساسيا في التسبب في IgAN. كما ذكرنا أعلاه ، نستخدم LPS لتحفيز خلايا DAKIKI ، والتي يمكن أن تطلق عوامل مؤيدة للالتهابات وتتوسط الاستجابات الالتهابية ، والتي يمكن أن تحاكي بشكل أفضل آلية الاستجابات المناعية المخاطية في IgAN. قد يساعد النموذج الخلوي في المختبر في التحقيق في إمكانية وآلية الأدوية الأخرى لعلاج IgAN. أظهرت النتائج أن DIO يثبط تكاثر خلايا DAKIKI التي يحفزها LPS بطريقة تعتمد على التركيز. يمكن أن يمنع DIO إفراز IgA و Gd-IgA1 في خلايا DAKIKI الناتجة عن تحفيز LPS وتنظيم التعبير عن mRNA وبروتين C1GalT1 ومرافقه Cosmc في خلايا DAKIKI ، مما يشير إلى أن DIO يمكن أن يقلل من إفراز Gd-IgA1 عن طريق تنظيم تعبير C1GALT1 / Cosmc وبالتالي يمنع التنشيط المفرط لخلايا DAKIKI.
يجب ملاحظة الخطوات الرئيسية أثناء الإجراءات التجريبية. تركيز Gd-IgA1 في طافية خلية DAKIKI ليس ضمن نطاق الكشف عن مجموعة ELISA (1.56 ~ 100 نانوغرام / مل) ، ويجب طرد المادة الطافية المجمعة بواسطة أنبوب ترشيح فائق للحصول على Gd-IgA1 المركز. تأكد أيضا من أن حجم المادة الطافية التي تبدأ من كل مجموعة هو نفسه وأن الحجم النهائي للتركيز الذي تم الحصول عليه بعد الترشيح الفائق هو نفسه.
في هذه الدراسة ، استخدمنا طرقا في المختبر وفي الجسم الحي في وقت واحد ، والتي يمكن أن تدعم بعضها البعض في التأثيرات الدوائية وتقدم مثالا لدراسة تأثيرات وآلياتها في طب الأعشاب. يمكن تحسين بعض الأشياء في هذا البروتوكول. أولا ، لم نكتشف تركيزات الدم في مجموعة DIO gavage للفئران. لذلك ، لا يتم استخدام تركيز DIO المكافئ لتركيزات الدم في التجارب المختبرية . ثانيا ، تم التحقيق فقط في مونومر DIO ، المكون النشط ل DNR ؛ لا تزال تأثيرات المكونات الأخرى ل DNR على IgAN بحاجة إلى مزيد من الدراسة.
في الختام ، توفر هذه الدراسة أساسا تجريبيا لعلاج IgAN باستخدام DIO ، المكون النشط ل DNR. أنشأت هذه الدراسة نموذجا مرضيا خلويا ل IgAN من خلال محاكاة الاستجابة المناعية المخاطية ل IgAN في المختبر وفي الجسم الحي. يعطي فكرة جديدة لدراسة الطب الصيني التقليدي لمنع وعلاج IgAN.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81973675).
Materials
| Anti-CD20/MS4A1 Antibody | Boster Biotechnology Company | A03780-3 | |
| Antifade mounting medium | Beyotime, Shanghai, China | P0128S | |
| Balb/c mice | Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 110322220101424000 | |
| blocking serum | Solarbio, Beijing, China | SL038 | |
| Bovine gamma globulin | ShangHai YuanYe Biotechnology Company | S12031 | |
| C1GALT1 polyclonal antibody | Proteintech Group, Inc,USA | 27569-1-AP | |
| Citrate antigen retrieval solution(50×) | Phygene Biotechnology Company | PH0422 | |
| COSMC polyclonal antibody | Proteintech Group, Inc,USA | 19254-1-AP | |
| Cytotoxiciy detection kit | Roche Company | 4744926001 | |
| Dako REAL EnVision detection system, Peroxidase/DAB+ | Dako | K5007 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Dioscin | National Institute For Food and Drug Control | 111707-201703 | |
| DIO tablets | Chengdu No 1 Pharmaceutical Co. Ltd. | H51023866 | |
| ECL working solution | Merck Biotechnology, Inc | WBKLS0100 | |
| Enhanced cell counting kit-8 | Beyotime, Shanghai, China | C0043 | |
| Fasking one-step removal of gene cDNA first-strand synthesis premix | TIANGEN,Beijing, China | KR118-02 | |
| Glycogen Periodic acid Schiff (PAS) stain kit | BaSO Biotechnology Company | BA4080A | |
| Goat anti-mouse IgA-AF488 | SouthernBiotech | 1040-30 | |
| Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L), HRP conjugated | BeiJing Bioss Biotechnology Company | BS-0295G-HRP | |
| Human Gd-IgA1 ELISA kit | IBL | 27600 | |
| Human IgA ELISA kit | MultiSciences (LiankeBio) | 70-EK174-96 | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| PMSF solution | Beyotime, Shanghai, China | ST507 | |
| Proteinase K | Phygene Biotechnology Company | PH1521 | |
| Rabbit anti-CXCR5 polyclonal antibody | BeiJing Bioss Biotechnology Company | bs-23570R | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime, Shanghai, China | P0013B | |
| RNAsimple total RNA extraction kit | TIANGEN,Beijing, China | DP419 | |
| RPMI Medium 1640 | Solarbio, Beijing, China | 31800 | |
| Super-Bradford protein assay kit | CWBIO, Beijing, China | CW0013 | |
| Triton X-100 | Beyotime, Shanghai, China | ST795 | |
| β-Actin Rabbit mAb | Abclonal, Wuhan, China | AC026 |
References
- Knoppova, B., et al. The origin and activities of IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy. Frontiers in Immunology. 7, 117 (2016).
- Suzuki, H., et al. The pathophysiology of IgA nephropathy. Journal of The American Society of Nephrology. 22 (10), 1795-1803 (2011).
- He, L., et al. Synthetic double-stranded RNA poly(I:C) aggravates IgA nephropathy by triggering IgA class switching recombination through the TLR3-BAFF axis. American Journal of Nephrology. 42 (3), 185-197 (2015).
- Zhao, N., et al. The level of galactose-deficient IgA1 in the sera of patients with IgA nephropathy is associated with disease progression. Kidney International. 82 (7), 790-796 (2012).
- Xing, Y., et al. C1GALT1 expression is associated with galactosylation of IgA1 in peripheral B lymphocyte in immunoglobulin a nephropathy. BMC Nephrology. 21 (1), 18 (2020).
- Qin, W., et al. External suppression causes the low expression of the Cosmc gene in IgA nephropathy. Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (5), 1608-1614 (2008).
- Sakai, F., et al. Lactobacillus gasseri SBT2055 induces TGF-β expression in dendritic cells and activates TLR2 signal to produce IgA in the small intestine. PLoS One. 9 (8), 105370 (2014).
- Gutzeit, C., Magri, G., Cerutti, A. Intestinal IgA production and its role in host-microbe interaction. Immunological Reviews. 260 (1), 76-85 (2014).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Lu, F., et al. Therapeutic effect of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae on gouty arthritis based on the SDF-1/CXCR 4 and p38 MAPK pathway: an in vivo and in vitro study. Phytotherapy research: PTR. 28 (2), 280-288 (2014).
- Wang, W., Xu, L., Zhou, L., Wan, S., Jiang, L. A Network pharmacology approach to reveal the underlying mechanisms of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae in the treatment of asthma. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2022, 4749613 (2022).
- Tian, W. W., Wei, Y. Professor TONG Xiaolin used the experience of Dioscoreae Nipponicae. Jilin Journal of Chinese Medicine. 40 (05), 589-592 (2020).
- Rao, X. R., Bai, Y. W. Das Xiwen’s experience in treating IgA nephropathy. Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine. 9, 691-693 (2008).
- Si, Y., Zhang, Y. A data mining study on the pattern of medication use in the treatment of IgA nephropathy by Professor Zhang Yu. Journal of Chinese Physician. 20 (01), 109-111 (2018).
- Jiang, H., et al. Optimization of the enzymatic extraction technology of Diosgenin from Dioscorea nipponica. Chinese Traditional Patent Medicine. 39 (03), 621-624 (2017).
- Qi, M., et al. Dioscin alleviates lipopolysaccharide-induced inflammatory kidney injury via the microRNA let-7i/TLR4/MyD88 signaling pathway. Pharmacological Research. 111, 509-522 (2016).
- Yang, L., et al. Recent advances in the pharmacological activities of Dioscin. BioMed Research International. 2019, 5763602 (2019).
- Nal Zou, J., et al. Toll-like receptor 4 signaling pathway in the protective effect of Pioglitazone on experimental immunoglobulin A nephropathy. Chinese Medical Journal. 130 (8), 906-913 (2017).
- Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experiments methodology. Chinese Pharmacological Bulletin. 1, 19 (1992).
- Shen, J. C., Ren, Y., Rao, X. R., You, Y., Li, S. Network pharmacology, molecular docking, and in vitro experiments to explore the molecular mechanism of Dioscorea Nipponica Makion in the treatment of IgA nephropathy. World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 16 (12), 2246-2254 (2021).
- Mestecky, J., et al. IgA nephropathy: molecular mechanisms of the disease. Annual Review of Pathology. 8, 217-240 (2013).
- Novak, J., et al. IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy differentially affect proliferation of mesangial cells. Kidney International. 67 (2), 504-513 (2005).
- Nihei, Y., et al. Identification of IgA autoantibodies targeting mesangial cells redefines the pathogenesis of IgA nephropathy. Science Advances. 9 (12), (2023).
- Raska, M., et al. Identification and characterization of CMP-NeuAc: GalNAc-IgA1 alpha2,6-sialyltransferase in IgA1-producing cells. Journal of Molecular Biology. 369 (1), 69-78 (2007).
.