Atténuation de la néphropathie à IgA médiée par la dioscine en inhibant l’activation des lymphocytes B in vivo et en diminuant la production d’IgA1 déficiente en galactose in vitro

Le comité d’éthique de l’hôpital de Guanganmen a approuvé cette expérience (numéro d’approbation éthique de l’expérimentation animale : IACUC-GAMH-2023-003). 1. Préparation des souris à la procédure expérimentale Élever 22 souris Balb/c mâles de grade SPF (âgées de 6 à 7 semaines, poids corporel de 20 à 25 g) dans l’animalerie de l’hôpital ou du centre de recherche. Répartissez les animaux en groupes témoins (n = 8) et modèles (n = 14) à l’aide de la méthode de la table de nombres aléatoires. Après 1 semaine d’élevage adaptatif en cage de laboratoire, nourrir le groupe modèle (groupe IgAN) avec une solution de gammaglobulines bovines (BGG) à 0,1 % dans de l’eau acidifiée contenant 6 mmol/L de HCl pendant 9 semaines selon le protocole de modélisation de Zou et al.18. Injecter 0,1 mL de solution saline de BGG à 0,1 % dans la veine de la queue pendant 3 jours consécutifs tout en continuant à boire la solution de BGG pour préparer un modèle de souris expérimental d’IgAN18. Laissez le groupe témoin boire librement 6 mmol/L d’eau acidifiée HCl sans BGG pendant 9 semaines. Injectez le volume correspondant de solution saline dans la veine de la queue pendant 3 jours consécutifs.REMARQUE : Les groupes de contrôle et de modèle ont été nourris avec la même qualité que l’alimentation normale. Après l’injection dans la veine caudale, sélectionnez au hasard 2 souris dans le groupe témoin et 2 souris dans le groupe modèle et examinez-les par protéinurie, microscopie optique et immunofluorescence pour déterminer si la modélisation a réussi.REMARQUE : Aucune nourriture n’est fournie aux animaux, mais ils ne sont pas interdits d’eau ; Enregistrer le débit d’urine. Recueillir l’urine pendant 24 h par des cages métaboliques et la centrifuger à 400 x g pendant 5 min ; jeter les sédiments d’urine. Après une dilution de 10 fois du surnageant, mesurer la concentration de protéinurie à l’aide d’un kit de dosage des protéines urinaires, puis multiplier par le facteur de dilution et le volume urinaire pour obtenir 24 h de protéines urinaires totales.REMARQUE : Les méthodes de microscopie et d’immunofluorescence sont présentées dans les sections 3 et 4, respectivement. Après avoir préparé le modèle avec succès, divisez 12 souris du groupe de modèles en 6 souris, chacune dans le groupe de modèles (groupe IgAN) et le groupe de gavage DIO (groupe DIO), selon la méthode de la table de nombres aléatoires. Que le groupe témoin continue à boire 6 mmol/L d’eau acidifiée HCl sans BGG, et le groupe modèle une solution BGG à 0,1 % composée d’eau acidifiée contenant 6 mmol/L de HCl. Calculer la dose d’administration par gavage du groupe DIO selon la formule de conversion de dose de la méthodologie expérimentale pharmacologique (convertie en fonction de la masse corporelle humaine de 70 kg)19. Gavage DIO comprimés 0,06 g/kg une fois par jour pendant 8 semaines. Après 8 semaines de gavage, anesthésier les souris par voie intrapéritonéale avec 0,4 % de pentobarbital sodique (60 mg/kg), et après avoir confirmé l’anesthésie appropriée par pincement des orteils, isolez les reins et le patch de Peyer pour des analyses ultérieures de microscopie optique et d’immunohistochimie.REMARQUE : Le schéma du modèle in vivo est présenté à la figure supplémentaire 1. 2. Analyse histologique Coupes de paraffine pour les reins et le patch de PeyerFixer des tissus rénaux de 3 mm d’épaisseur ou 1 patch de Peyer avec 4% de paraformaldéhyde pendant 24 h, déshydrater avec de l’éthanol dégradé et du xylène. Tremper dans la cire pendant 2 h, sceller et congeler. Coupez des sections de reins de 2 m d’épaisseur et des sections de patch de Peyer de 4 m d’épaisseur et étalez-les dans de l’eau tiède. Ramassez les tranches dépliées à l’aide d’une lame en verre propre et faites-les cuire dans un four à température constante à 40 °C pendant 1 h. Commencer la coloration après le prétraitement de l’échantillon.REMARQUE : Prenez la surface coronale de la partie hilaire du rein, avec une épaisseur de bloc de tissu de 3 mm. Décaffinez et colorez les sections de paraffine à température ambiante (RT) pendant 10 min avec une solution acide périodique, en évitant la lumière. Rincez à l’eau distillée et essuyez à sec avec la solution de coloration Schiff’s pendant 20 à 30 min, en évitant la lumière. Rincer à l’eau distillée jusqu’à ce que les sections soient rouges au microscope. Placez les sections dans une solution de coloration à l’hématoxyline, colorez les noyaux pendant 3 minutes (les noyaux trop profondément colorés peuvent être divisés par du chlorhydrate d’éthanol) et rincez à l’eau courante jusqu’à ce que les lames soient incolores. Effectuez une déshydratation de routine avec des concentrations dégradées d’éthanol et de xylène, scellez les sections avec de la gomme neutre et observez au microscope. Le PAS-positif est rouge et le noyau est bleu. 3. Analyse immunohistochimique du patch de Peyer Préparez des sections de paraffine du patch de Peyer comme décrit à l’étape 2.1.REMARQUE : L’épaisseur des sections pour l’immunohistochimie et l’immunofluorescence ultérieure est de 4 μm. Décaffinez les sections de paraffine :Placez les sections dans le xylène I pendant 5 min, le xylène II pendant 5 min et le xylène III pendant 5 min. De plus, rincez les lames dans de l’éthanol anhydre I pendant 5 min, de l’éthanol anhydre II pendant 5 min, de l’alcool à 85 % pendant 5 min, de l’alcool à 75 % pendant 5 min. Rincez ensuite les lames à l’eau distillée. Récupération d’antigènesPréparez une solution mère de citrate de sodium 50x et diluez-la avec de l’eau distillée à 1x pour l’utilisation. Chauffez-le dans un autoclave pendant 2 min, puis placez les tranches dans l’autoclave en veillant à ce que le niveau de liquide dépasse le niveau des tranches. Faites chauffer à haute température pendant 5 min, puis laissez les lames refroidir naturellement. Lavez les tranches trois fois avec la solution PBS pendant 5 minutes chacune. Blocage de la peroxydase endogène : Marquez les bords du tissu dans un cercle avec un stylo immunohistochimique. Incuber les sections dans une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 15 minutes à l’heure de l’art, à l’abri de la lumière, et laver les sections trois fois avec une solution PBS pendant 5 minutes à chaque fois. Blocage du sérum : Bloquez les sections en déposant 10 % de sérum de chèvre sur les sections de tissus marquées pendant 30 minutes à RT. Assurez-vous que les sections sont uniformément recouvertes de la tache. Incubation de l’anticorps primaire : Secouez doucement la solution bloquante et ajoutez une proportion de l’anticorps primaire préparé (CD20 [1:800] ; CXCR5 [1:800]) à la section. Placez la section à plat dans une boîte humide et incubez toute la nuit à 4 °C.REMARQUE : Ajoutez une petite quantité d’eau dans la boîte humide pour éviter l’évaporation de l’anticorps. Incubation secondaire d’anticorps : Lavez les sections trois fois avec une solution de PBS pendant 5 minutes à chaque fois. Retirez le PBS en secouant les sections pour les sécher, couvrez le tissu avec une goutte d’anticorps secondaire (HRP-label) de l’espèce apparentée de l’anticorps primaire, et incubez à RT pendant 50 min. Homogénéisation de la 3,3′-diaminobenzidine (DAB) : Laver les sections avec une solution de PBS trois fois pendant 5 minutes chacune. Après avoir secoué les sections pour les sécher, déposez la solution chromogène DAB fraîchement préparée sur les sections. Observer le temps de développement des couleurs au microscope ; Le positif est jaune brunâtre. Rincer à l’eau du robinet pour terminer le développement de la couleur. Coloration des noyaux : Colorez à nouveau avec de l’hématoxyline pendant environ 1 min, lavez à l’eau du robinet, puis rincez pendant 10 min à l’eau du robinet pour revenir au bleu. Déshydratation et scellement :Placez les sections dans de l’alcool à 75 % pendant 5 min et à 85 % d’alcool pendant 5 min. Placez les sections dans de l’éthanol anhydre I pendant 5 min, de l’éthanol anhydre II pendant 5 min et de l’éthanol anhydre III pendant 5 min. Lavez les sections dans du xylène I pendant 5 min, sortez-les pour les faire sécher légèrement et scellez les sections avec de la gomme neutre. Acquisition d’images : Collectez des images par examen microscopique et analysez-les à l’aide d’un logiciel halo pour l’analyse d’images panoramiques du tissu.REMARQUE : Les noyaux colorés à l’hématoxyline sont bleus, et l’expression positive du DAB est observée sous forme de jaune brunâtre. 4. Immunofluorescence rénale IgA Préparez des coupes de paraffine pour les reins comme décrit à l’étape 2.1. Décaffiner les sections de paraffine :Placez les sections dans le xylène I pendant 5 min, le xylène II pendant 5 min et le xylène III pendant 5 min. Traitez les sections avec de l’éthanol anhydre I, de l’éthanol anhydre II, de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 90 %, de l’éthanol à 80 %, de l’éthanol à 70 % et de l’éthanol à 50 %, pendant 5 min, et lavez-les à l’eau distillée. Récupération de la protéinase K : Secouez les sections pour les sécher et tracez un cercle autour de la section de tissu avec un stylo histochimique. Ajouter la solution de travail de protéinase K (rapport 1:9 de la solution mère et du PBS) goutte à goutte pour couvrir le tissu et incuber à 37 °C pendant 30 min. Lavez les sections trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. Pénétration de la membrane cellulaire : Secouez légèrement les sections pour les sécher, puis couvrez-les de Triton à 0,1 %. Incuber pendant 20 min à RT et laver les sections trois fois avec du PBS pendant 5 min chacune. Blocage : Ajouter 10 % de sérum de chèvre goutte à goutte pour couvrir uniformément les tissus pour le blocage à la RT pendant 30 min. Incubation primaire de l’anticorps : Ajouter une quantité appropriée d’anticorps IgA conjugués anti-souris AF488 de chèvre (1:500) goutte à goutte pour couvrir uniformément le tissu et incuber toute la nuit à 4 °C. Coloration des noyaux : Lavez les tranches trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. Après avoir retiré le PBS, ajoutez le colorant 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) goutte à goutte sur les sections et incubez pendant 15 min à RT, à l’abri de la lumière. Laver et sceller les sections : Lavez les sections trois fois avec du PBS pendant 5 min, puis scellez-les avec un support de montage anti-décoloration. Microscopie et photographie : Observez les coupes au microscope fluorescent et prenez des images.REMARQUE : Pour DAPI, l’excitation ultraviolette est de longueur d’onde 330-380 nm et la longueur d’onde d’émission est de 420 nm, lumière bleue. La longueur d’onde d’excitation de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) est de 465 à 495 nm et la longueur d’onde d’émission est de 515 à 555 nm, lumière verte. 5. Culture cellulaire Obtenir la lignée de lymphocytes B humains DAKIKI auprès de l’ATCC, aux États-Unis. Culture de cellules DAKIKI dans un milieu RPMI-1640 complété par 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 et sous-cultivez-les tous les 2-3 jours. Utilisez des cellules en phase de croissance logarithmique pour toutes les expériences. À 70 %-80 % de confluence, prélever les cellules à l’aide d’une pipette stérile et centrifuger les cellules à 140 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant, mettez-le en suspension avec le milieu sans sérum et, après 24 heures, laissez toutes les cellules dans une période de repos pour un traitement ultérieur. 6. Tests de cytotoxicité LDH pour le dépistage de concentrations sûres de DIO sur des cellules DAKIKI normales Ensemencez les cellules DAKIKI dans des plaques de 96 puits à une densité de 4×105 cellules/puits et mettez en place un groupe témoin faible, un groupe témoin élevé et différentes concentrations de DIO (0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 μg/mL). Incuber dans un incubateur à 5% de CO2, 37 °C pendant 24 h après le traitement correspondant selon la méthode de regroupement. Selon les instructions du kit de détection de la cytotoxicité, ajoutez 5 μL de lysat par puits dans le groupe témoin élevé, puis placez la plaque dans un incubateur à 5 % de CO2, 37 °C pendant 15 min. Sortez la plaque, ajoutez 100 μL du mélange réactionnel dans chaque puits, incubez dans l’obscurité pendant 10 min à RT, puis ajoutez 50 μL de la solution d’arrêt de la réaction. Mesurez la valeur OD à 490 nm sur le lecteur de microplaques dès que possible. Calculer le taux de libération de LDH de différentes concentrations de DIO et de ≤10 % comme dose maximale administrée selon la formule : Taux de libération de LDH = (LDH bien expérimentale – LDH faiblement témoin) / (LDH haute maîtrise – LDH faible) x 100 %. 7. Test CCK-8 pour détecter l’effet de DIO sur la prolifération cellulaire DAKIKI Sur la base des résultats de nos expériences précédentes20, établissez un modèle IgAN utilisant LPS 40 μg/mL pour induire des cellules DAKIKI. Ensuite, ensemencez 4 x 105 cellules/puits dans des plaques de 96 puits et divisez-les en groupes de contrôle, de modèle et d’ID numériques à faible, moyenne et haute concentration (0,25 μg/mL, 0,5 μg/mL et 1,0 μg/mL). Incuber les plaques dans un incubateur à 5 % de CO2, 37 °C pendant 24 h. Ensuite, ajoutez 20 μL de réactif CCK-8 dans chaque puits et remettez les plaques dans l’incubateur (5 % CO2, 37 °C) pendant 2 h. Après l’incubation, détectez le DO à une longueur d’onde de 450 nm sur le lecteur de microplaques dès que possible. 8. ELISA pour détecter l’effet de la DIO sur la sécrétion d’IgA et de Gd-IgA1 par les cellules DAKIKI Ensemencez les cellules DAKIKI dans des plaques de 6 puits à une densité de 6×106 cellules/puits, puis regroupez et traitez les cellules selon l’étape 7.2. Cultiver les cellules pendant 24 h, puis centrifuger à 850 x g pendant 10 min à 4 °C pour obtenir le surnageant. Détectez les concentrations d’IgA et de Gd-IgA1 conformément aux instructions du kit. 9.qRT-PCR pour détecter l’effet de la DIO sur les niveaux d’ARNm C1GALT1 et Cosmc dans les cellules DAKIKI Ensemencez les cellules DAKIKI à une densité de 6×106 cellules/puits dans une plaque à 6 puits, regroupez et traitez les cellules comme CCK8 mentionné à l’étape 7.2, et incubez pendant 24 h. Extrayez l’ARN total des cellules DAKIKI selon les instructions du kit d’extraction d’ARN total. Après avoir prélevé 1 μL d’ARN extrait de chaque groupe d’échantillons et mesuré sa concentration, transcrivez inversement 1 μg d’ARN total de chaque échantillon en ADNc selon les instructions du kit. Ensuite, effectuez une amplification RT-PCR pour détecter l’expression de chaque gène (95 °C pendant 15 min, 95 °C pendant 10 s et 60 °C pendant 30 s). Calculez le niveau d’expression de chaque gène à l’aide de la méthode 2-ΔΔCT avec la β-actine comme référence interne.REMARQUE : Les séquences d’amorce étaient les suivantes :C1GALT1 : 5′-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3′, 5′-CTTTGACGTGTGTGGCCTTT-3′ ;Cosmc : 5′-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3′, 5′-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3′ ;β-actine : 5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′, 5′-CAGCGGAACCGCTCTCATTGCCAATGG-3′. 10. Western blot pour examiner l’effet de DIO sur l’expression des protéines C1GALT1 et Cosmc dans les cellules DAKIKI Ensemencez les cellules DAKIKI à une densité de 6×106 cellules/puits dans une plaque à 6 puits. Regroupez-les et traitez-les comme mentionné à l’étape 7.2. Après 24 h d’incubation, prélever chaque groupe de cellules. Ajouter une quantité appropriée de solution de lyse cellulaire (PMSF : inhibiteur de la phosphatase : solution de lyse RIPA = 1:1:100) et incuber sur glace pendant 30 min. Ensuite, centrifuger à 13 500 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant. Déterminez la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage de la concentration en protéines BCA. Mélangez les échantillons de protéines avec 5 tampons de chargement SDS-PAGE à 4:1 par vortex, et chauffez les échantillons mélangés à 100 °C pendant 5 min pour dénaturer la protéine. Pour détecter des protéines de poids moléculaires différents, ajoutez le marqueur protéique (5 μL/puits) et des échantillons (20 μg/puits) dans différentes voies d’un gel SDS-PAGE à 12 %, effectuez une électrophorèse SDS-PAGE et transférez le gel sur des membranes PVDF. Bloquer les membranes avec du lait écrémé à 5 % pendant 2 h à la RT et incuber avec les anticorps primaires correspondants (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) pendant 24 h. Utiliser l’anticorps β-actine (1:100000) comme contrôle interne. Laver la membrane en fluorure de polyvinylidène (PVDF) avec 1x sérum physiologique tamponné Tris, détergent Tween 20 à 0,1 % (TBST) trois fois (10 min/temps), puis incuber avec l’anticorps IgG anti-lapin secondaire de chèvre correspondant (1:10000) à RT pendant 2 h. Lavez de nouveau la membrane avec du TBST (trois fois pendant 10 minutes chacune) et traitez-la avec une quantité appropriée de solution de travail à chimiluminescence améliorée (ECL) (selon les instructions du fabricant) pour la détection des bandes protéiques. Capturez les images à l’aide du système d’imagerie par chimiluminescence et effectuez une analyse semi-quantitative des valeurs de gris des protéines à l’aide du système d’analyse d’images Image J. 11. Aéroport internationalAnalyse statistique Utilisez un logiciel approprié pour analyser les données. Exprimez toutes les données comme moyennes ± écart-type (écart-type) et évaluez plusieurs échantillons à l’aide d’un test ANOVA à un facteur pour la comparaison entre les groupes.REMARQUE : Le logiciel statistique SPSS 26.0 a été utilisé pour l’analyse statistique. La méthode LSD a été utilisée pour les comparaisons à deux facteurs entre les groupes lorsque les variances étaient égales, et la méthode Dunnett T3 a été utilisée pour les comparaisons à deux facteurs entre les groupes lorsque les variances n’étaient pas égales. P<0,05 a été considéré comme indiquant une différence statistiquement significative.