in vivoでのB細胞活性化の阻害とin vitroでのガラクトース欠損IgA1産生の減少によるジオシン媒介性IgA腎症の緩和

広安門病院の倫理委員会は、この実験を承認しました(動物実験倫理承認番号:IACUC-GAMH-2023-003)。 1. 実験手順のためのマウスの準備 SPFグレードの雄Balb/cマウス22匹(生後6-7週齢、体重20-25g)を病院/研究センターの動物施設で飼育します。乱数表法を使用して、動物を制御群(n = 8)とモデル群(n = 14)に分けます。 実験室のケージで1週間の適応飼育を行った後、モデルグループ(IgANグループ)に0.1%ウシガンマグロブリン(BGG)溶液を6mmol / L HClを含む酸性水に9週間与えます。 0.1 mLの生理食塩水入り0.1 mLを尾静脈に注入し、BGG溶液を飲み続けながら3日間連続して注入し、IgAN実験マウスモデル18を調製します。 対照群にBGGを含まない6mmol / L HCl酸性水を9週間自由に飲ませます。対応する量の生理食塩水を尾静脈に連続して3日間注入します。注:コントロールグループとモデルグループには、通常のフィードと同じ品質が供給されました。 尾静脈注射後、対照群のマウス2匹とモデル群のマウス2匹をランダムに選択し、タンパク尿、光学顕微鏡、免疫蛍光法で調べてモデリングが成功したかどうかを判断します。注:動物には食べ物は提供されませんが、水を飲むことは禁止されていません。尿量を記録します。 代謝ケージで24時間尿を採取し、400 x g で5分間遠心分離します。尿沈殿物を捨てます。上清を10倍に希釈した後、尿タンパク質アッセイキットを使用してタンパク尿濃度を測定し、希釈係数と尿量を掛けて、24時間の総尿タンパク質を取得します。.注:顕微鏡法と免疫蛍光法は、それぞれセクション3と4に示されています。 モデルの準備に成功したら、モデルグループ内の12匹のマウスを、乱数表法に従って、モデルグループ(IgANグループ)とDIO強制グループ(DIOグループ)のそれぞれ6匹のマウスに分割します。 対照群にBGGなしで6mmol/L HCl酸性水を飲み続けさせ、6mmol/L HClを含む酸性水で構成されたモデル群0.1%BGG溶液を飲ませます。薬理学的実験方法論の用量換算式に従ってDIO群強制経口投与の用量を計算します(人体の70kgの体重に応じて換算)19。DIO錠0.06g / kgを1日1回8週間強制経口投与します。. 8週間の強制経口投与後、マウスを0.4%ペントバルビタールナトリウム(60 mg / kg)で腹腔内に麻酔し、つま先をつまんで適切な麻酔を確認した後、腎臓とパイエルパッチを分離して、その後の光学顕微鏡検査および免疫組織化学分析。.注: in vivo モデルのスキームは 、補足 図1にあります。 2. 組織学的解析 腎臓のパラフィン切片とパイエルパッチ厚さ3 mmの腎臓組織または1つのパイエルパッチを4%パラホルムアルデヒドで24時間固定し、グラジエントエタノールとキシレンで脱水します。ワックスに2時間浸し、密封して凍結します。 厚さ2 μmの腎臓切片と厚さ4 μmのパイエルパッチ切片を切開し、温水に広げます。広げたスライスをきれいなスライドガラスですくい取り、40°Cの恒温オーブンで1時間焼きます。試料の前処理後に染色を開始します。注:腎臓の肺門部分の冠状表面を、厚さ3mmの組織ブロックで取ります。 パラフィン切片を脱ワックスし、室温(RT)で過ヨウ素酸溶液で10分間、光を避けて染色します。蒸留水ですすぎ、光を避けながら、シッフの染色液で20〜30分間乾燥染色した状態で拭きます。顕微鏡下で切片が赤くなるまで蒸留水ですすいでください。 切片をヘマトキシリン染色溶液に入れ、核を3分間染色し(深く染色しすぎる核は塩酸エタノールで分割できます)、スライドが無色になるまで流水ですすいでください。 エタノールとキシレンのグラジエン濃度で日常的な脱水を行い、切片を中性ガムで密封し、顕微鏡で観察します。PAS陽性は赤、核は青です。 3. パイエル板の免疫組織化学的解析 ステップ2.1で説明したように、パイエルパッチのパラフィン切片を調製します。注:免疫組織化学およびその後の免疫蛍光染色の切片の厚さは4μmです。 パラフィン切片を脱ろうします。切片をキシレンIに5分間、キシレンIIに5分間、キシレンIIIに5分間入れます。 さらに、スライドを無水エタノールIで5分間、無水エタノールIIで5分間、85%アルコールで5分間、75%アルコールで5分間すすぎます。次に、スライドを蒸留水ですすいでください。 抗原賦活化クエン酸ナトリウムの50倍ストック溶液を調製し、蒸留水で1倍に希釈して使用します。オートクレーブで2分間加熱した後、スライスをオートクレーブに入れ、液面がスライスのレベルを超えることを確認します。 高温で5分間加熱した後、スライドを自然に冷まします。スライスをPBS溶液で3回、それぞれ5分間洗浄します。 内因性ペルオキシダーゼのブロッキング:免疫組織化学ペンで組織の境界を円でマークします。切片を3%過酸化水素溶液中で室温で15分間インキュベートし、光から保護し、切片をPBS溶液で毎回5分間3回洗浄します。 血清ブロッキング:RTで30分間マークされた組織切片に10%ヤギ血清を滴下して切片をブロックします。 一次抗体のインキュベーション:ブロッキング溶液を静かに振り落とし、調製した一次抗体(CD20 [1:800];CXCR5 [1:800]) をセクションに追加しました。切片をウェットボックスに平らに置き、4°Cで一晩インキュベートします。注:抗体の蒸発を防ぐために、ウェットボックスに少量の水を加えてください。 二次抗体インキュベーション:切片をPBS溶液で毎回5分間3回洗浄します。切片を振ってPBSを除去し、一次抗体の関連種の二次抗体(HRP標識)を組織に一滴垂らし、室温で50分間インキュベートします。 3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)の均質化:切片をPBS溶液で5分間ずつ3回洗浄します。切片を振って乾かした後、新たに調製したDAB発色性溶液を切片に滴下します。顕微鏡で発色時間を観察します。ポジは茶色がかった黄色です。水道水ですすいで発色を終了します。 核の染色:ヘマトキシリンで約1分間再染色し、水道水で洗浄した後、水道水で10分間すすぎ、青色に戻します。 脱水とシーリング:切片をアルコール75%に5分間、アルコール85%に5分間入れます。切片を無水エタノールIに5分間、無水エタノールIIに5分間、無水エタノールIIIに5分間入れます。 切片をキシレンIで5分間洗い、取り出して少し乾かし、切片を中性ガムで密封します。 画像取得:顕微鏡検査で画像を収集し、ハローソフトウェアで分析して組織のパノラマ画像分析を行います。注:ヘマトキシリン染色された核は青色で、DAB陽性発現は茶色がかった黄色で観察されます。 4. 腎IgA免疫蛍光法 ステップ2.1で説明されているように、腎臓のパラフィン切片を準備します。 脱ワックスパラフィンセクション:切片をキシレンIに5分間、キシレンIIに5分間、キシレンIIIに5分間入れます。無水エタノールI、無水エタノールII、95%エタノール、90%エタノール、80%エタノール、70%エタノール、および50%エタノールの切片をそれぞれ5分間処理し、蒸留水で洗浄します。. プロテイナーゼKの賦活化:切片を振って乾かし、組織化学ペンで組織切片の周りに円を描きます。プロテイナーゼKワーキング溶液(ストック溶液とPBSの比率1:9)を滴下して組織を覆い、37°Cで30分間インキュベートします。切片をPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。 細胞膜への浸透:切片を少し振って乾かし、0.1%トリトンで覆います。室温で20分間インキュベートし、切片をPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。 ブロッキング:10%のヤギ血清を滴下して組織を均一に覆い、RTで30分間ブロッキングします。 一次抗体のインキュベーション:ヤギ抗マウスAF488-標識IgA抗体(1:500)を適量滴下して組織を均一に覆い、4°Cで一晩インキュベートします。 核の染色:スライスをPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。PBSを除去した後、切片に4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色液を滴下し、光から保護された室温で15分間インキュベートします。 切片の洗浄と密封:切片をPBSで5分間3回洗浄した後、退色防止剤封入剤で密封します。 顕微鏡と写真撮影:蛍光顕微鏡で切片を観察し、画像を撮影します。注意: DAPIの場合、紫外線励起は波長330〜380 nm、発光波長は420 nm、青色光です。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)の励起波長は465-495 nmで、発光波長は515-555 nm、緑色光です。 5. 細胞培養 ヒトBリンパ球株DAKIKIを米国ATCCから入手します。10% FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地でDAKIKI細胞を培養します。 細胞を37°C、5%CO2 インキュベーターで培養し、2〜3日ごとに継代培養します。すべての実験で対数成長期の細胞を使用してください。 70%〜80%のコンフルエントで、滅菌ピペットで細胞を回収し、細胞を140 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、無血清培地で再懸濁し、24時間後、すべての細胞をその後の治療のために静止期間に放置します。. 6. 正常なDAKIKI細胞上の安全な濃度のDIOをスクリーニングするためのLDH細胞毒性アッセイ 96ウェルプレートに4×105 細胞/ウェルの密度でDAKIKI細胞を播種し、低コントロール群、高コントロール群、および異なる濃度のDIO(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/mL)を設定します。5% CO2, 37 °Cインキュベーターで、対応する処理後、グループ化方法に従って24時間インキュベートします。 細胞毒性検出キットの指示に従って、高対照群のウェルあたり5 μLのライセートを加え、プレートを5% CO2, 37 °Cインキュベーターに15分間置きます。 プレートを取り出し、各ウェルに反応混合物100μLを加え、室温で10分間暗所でインキュベートした後、停止反応液50μLを加えます。できるだけ早くマイクロプレートリーダーで490nmのOD値を測定してください。 さまざまな濃度のDIOのLDH放出率を計算し、最大投与量として≤10%を次の式に従って計算します:LDH放出率=(実験井LDH – 低制御LDH)/(高制御LDH – 低制御LDH)x 100%。 7. DIOのDAKIKI細胞増殖への影響を検出するためのCCK-8アッセイ これまでの実験結果20に基づき、LPS 40 μg/mLを用いたIgANモデルを確立し、DAKIKI細胞を誘導する。 次に、96ウェルプレートに4×105 細胞/ウェルを播種し、コントロール、モデル、およびDIOの低、中、高濃度グループ(0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、および1.0 μg/mL)に分けます。プレートを5% CO2、37°Cインキュベーターで24時間インキュベートします。 次に、20 μLのCCK-8試薬を各ウェルに加え、プレートをインキュベーター(5% CO2、37°C)に2時間戻します。インキュベーション後、できるだけ早くマイクロプレートリーダーで波長450nmのODを検出します。 8. DAKIKI細胞によるIgAおよびGd-IgA1の分泌に対するDIOの影響を検出するためのELISA DAKIKI細胞を6×106 細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種し、ステップ7.2に従って細胞をグループ化して処理します。細胞を24時間培養した後、850 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を得ます。 キットの指示に従って、IgAおよびGd-IgA1濃度を検出します。 9.DAKIKI細胞のC1GALT1およびCosmc mRNAレベルに対するDIOの影響を検出するためのqRT-PCR DAKIKI細胞を6ウェルプレートに6×106 細胞/ウェルの密度で播種し、ステップ7.2で述べたCCK8として細胞をグループ化して処理し、24時間インキュベートします。DAKIKI細胞からtotal RNAをtotal RNA抽出キットの指示に従って抽出します。 各サンプル群から抽出したRNA1 μLを採取し、その濃度を測定した後、キットの指示に従って、各サンプルからtotal RNAの1 μgを逆方向にcDNAに転写します。 次に、RT-PCR増幅を行い、各遺伝子の発現を検出します(95°Cで15分間、95°Cで10秒間、60°Cで30秒間)。β-アクチンを内部参照とする2-ΔΔCT 法を用いて、各遺伝子の発現量を計算します。注:プライマー配列は以下の通りである。C1GALT1: 5′-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3′, 5′-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3′;Cosmc: 5′-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3′, 5′-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3′;β-アクチン:5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’、5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’。 10. DAKIKI細胞におけるDIOのC1GALT1およびCosmcタンパク質発現に対するDIOの影響を検討するためのウェスタンブロッティング DAKIKI細胞を6×106 細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種します。手順7.2で説明したようにグループ化して扱います。インキュベーションの24時間後、細胞の各グループを収集します。 細胞溶解液(PMSF:ホスファターゼ阻害剤:RIPA溶解液=1:1:100)を適量加え、氷上で30分間インキュベートします。次に、13,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を回収します。 BCAタンパク質濃度アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定します。 タンパク質サンプルをボルテックスにより5x SDS-PAGEローディングバッファーと4:1でボルテックスして混合し、混合サンプルを100°Cで5分間加熱してタンパク質を変性させます。 分子量の異なるタンパク質を検出するには、タンパク質マーカー(5 μL/well)とサンプル(20 μg/well)を12% SDS-PAGEゲルの異なるレーンに添加し、SDS-PAGE電気泳動を行い、ゲルをPVDFメンブレンに移します。 5%脱脂乳でメンブレンを室温で2時間ブロックし、対応する一次抗体(C1GALT1 [1:1000]、Cosmc [1:2000])と24時間インキュベートします。β-アクチン抗体(1:100000)を内部コントロールとして使用します。 ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンを1x Tris-Buffered Saline、0.1% Tween 20界面活性剤(TBST)で3回(10分/回)洗浄し、対応する二次ヤギ抗ウサギIgG抗体(1:10000)と室温で2時間インキュベートします。 メンブレンをTBSTで再度洗浄し(各10分間を3回)、タンパク質バンド検出のために適切な量の増強化学発光(ECL)ワーキング溶液(製造元の指示に従って)で処理します。 化学発光イメージングシステムを使用して画像を取得し、Image J画像解析システムを使用してタンパク質のグレー値の半定量的分析を実行します。 11. 統計分析 データの分析には、適切なソフトウェアアプリケーションを使用してください。すべてのデータをSD(標準偏差)±平均値として表し、グループ間の比較のために一元配置ANOVA検定によって複数のサンプルを評価します。注:統計分析には、SPSS統計ソフトウェア26.0を使用しました。分散が等しい場合のグループ間の二元配置比較にはLSD法を使用し、分散が等しくない場合のグループ間の二元配置比較にはDunnett T3法を使用しました。P<0.05は統計学的に有意な差を示すと考えられた。