Alleviamento della nefropatia da IgA mediata dalla dioscina inibendo l'attivazione delle cellule B in vivo e diminuendo la produzione di IgA1 carente di galattosio in vitro

Il comitato etico dell’ospedale di Guanganmen ha approvato questo esperimento (numero di approvazione etica dell’esperimento animale: IACUC-GAMH-2023-003). 1. Preparazione dei topi per la procedura sperimentale Allevare 22 topi maschi Balb/c di grado SPF (6-7 settimane di età, peso corporeo 20-25 g) nella struttura per animali dell’ospedale/centro di ricerca. Dividi gli animali in gruppi di controllo (n = 8) e modello (n = 14) utilizzando il metodo della tabella dei numeri casuali. Dopo 1 settimana di allevamento adattativo nella gabbia di laboratorio, nutrire il gruppo modello (gruppo IgAN) con una soluzione di gamma globulina bovina (BGG) allo 0,1% in acqua acidificata contenente 6 mmol/L di HCl per 9 settimane secondo il protocollo di modellazione di Zou et al.18. Iniettare 0,1 mL di soluzione di BGG allo 0,1% in soluzione salina nella vena caudale per 3 giorni consecutivi continuando a bere la soluzione di BGG per preparare un modello murino sperimentale di IgAN18. Lasciare che il gruppo di controllo beva liberamente 6 mmol/L di acqua acidificata HCl senza BGG per 9 settimane. Iniettare il volume corrispondente di soluzione fisiologica nella vena caudale per 3 giorni consecutivi.NOTA: I gruppi di controllo e di modello sono stati alimentati con la stessa qualità del mangime normale. Dopo l’iniezione della vena caudale, selezionare 2 topi nel gruppo di controllo e 2 topi nel gruppo modello in modo casuale ed esaminarli mediante proteinuria, microscopia ottica e immunofluorescenza per determinare se la modellazione ha avuto successo.NOTA: Non viene fornito cibo agli animali, ma non è vietato loro dall’acqua; registrare la produzione di urina. Raccogliere l’urina per 24 ore tramite gabbie metaboliche e centrifugarla a 400 x g per 5 min; Scartare il sedimento urinario. Dopo una diluizione di 10 volte del surnatante, misurare la concentrazione di proteinuria utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine urinarie e quindi moltiplicare per il fattore di diluizione e il volume delle urine per ottenere 24 ore di proteine urinarie totali.NOTA: I metodi di microscopia e immunofluorescenza sono mostrati rispettivamente nelle sezioni 3 e 4. Dopo aver preparato con successo il modello, dividere 12 topi del gruppo modello in 6 topi, ciascuno nel gruppo modello (gruppo IgAN) e nel gruppo DIO gavage (gruppo DIO), secondo il metodo della tabella dei numeri casuali. Lasciare che il gruppo di controllo continui a bere 6 mmol/L di HCl di acqua acidificata senza BGG e che il gruppo modello prosegua con una soluzione di BGG allo 0,1% composta da acqua acidificata contenente 6 mmol/L di HCl. Calcolare la dose di somministrazione di sonda gastrica del gruppo DIO secondo la formula di conversione della dose della metodologia sperimentale farmacologica (convertita in base alla massa corporea umana di 70 kg)19. Gavage DIO compresse 0,06 g/kg una volta al giorno per 8 settimane. Dopo 8 settimane di gavagage, anestetizzare i topi per via intraperitoneale con pentobarbital sodico allo 0,4% (60 mg/kg) e, dopo aver confermato la corretta anestesia con il pizzicamento delle dita, isolare i reni e il cerotto di Peyer per le successive analisi di microscopia ottica e immunoistochimica.NOTA: Lo schema per il modello in vivo è riportato nella Figura 1 supplementare. 2. Analisi istologica Sezioni di paraffina per i reni e cerotto di PeyerFissare tessuti renali spessi 3 mm o 1 cerotto di Peyer con paraformaldeide al 4% per 24 ore, disidratare con etanolo a gradiente e xilene. Immergere nella cera per 2 ore, sigillare e congelare. Tagliare sezioni di rene spesse 2 μm e sezioni di cerotto di Peyer spesse 4 μm e stenderle in acqua tiepida. Raccogliere le fette aperte con un vetrino pulito e cuocerle in forno a temperatura costante a 40 °C per 1 ora. Iniziare la colorazione dopo la pre-elaborazione del campione.NOTA: Prendere la superficie coronale della parte ilare del rene, con uno spessore di 3 mm di blocco di tessuto. Decerare e colorare le sezioni di paraffina a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti con soluzione acida periodica, evitando la luce. Risciacquare con acqua distillata e asciugare le macchie con la soluzione colorante di Schiff per 20-30 minuti, evitando la luce. Sciacquare con acqua distillata fino a quando le sezioni non sono diventate rosse al microscopio. Mettere le sezioni nella soluzione colorante di ematossilina, colorare i nuclei per 3 minuti (i nuclei colorati troppo profondamente possono essere divisi da etanolo cloridrato) e risciacquare con acqua corrente fino a quando i vetrini non sono incolori. Eseguire la disidratazione di routine con concentrazioni in gradiente di etanolo e xilene, sigillare le sezioni con gomma neutra e osservare al microscopio. PAS-positivo è rosso e il nucleo è blu. 3. Analisi immunoistochimica della macchia di Peyer Preparare le sezioni di paraffina del cerotto di Peyer come descritto al punto 2.1.NOTA: Lo spessore delle sezioni per l’immunoistochimica e la successiva immunofluorescenza è di 4 μm. Decerare le sezioni di paraffina:Mettere le sezioni nello xilene I per 5 minuti, nello xilene II per 5 minuti e nello xilene III per 5 minuti. Inoltre, sciacquare i vetrini con etanolo anidro I per 5 minuti, etanolo anidro II per 5 minuti, alcol all’85% per 5 minuti, alcol al 75% per 5 minuti. Quindi sciacquare i vetrini in acqua distillata. Recupero dell’antigenePreparare 50 volte la soluzione madre di citrato di sodio e diluirla con acqua distillata fino a 1 volta per l’uso. Scaldarlo in autoclave per 2 minuti, quindi mettere le fette in autoclave, assicurandosi che il livello del liquido superi il livello delle fette. Scaldare ad alta temperatura per 5 minuti, quindi lasciare raffreddare naturalmente i vetrini. Lavare le fette tre volte con la soluzione PBS per 5 minuti ciascuna. Blocco della perossidasi endogena: segnare i bordi del tessuto in un cerchio con una penna immunoistochimica. Incubare le sezioni in una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 15 minuti a RT, al riparo dalla luce, e lavare le sezioni tre volte con una soluzione di PBS per 5 minuti ogni volta. Blocco del siero: bloccare le sezioni facendo cadere il 10% di siero di capra sulle sezioni di tessuto contrassegnate per 30 minuti a RT. Assicurarsi che le sezioni siano uniformemente coperte dalla macchia. Incubazione degli anticorpi primari: Scuotere delicatamente la soluzione bloccante e aggiungere una parte dell’anticorpo primario preparato (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) alla sezione. Posizionare la sezione piatta in una scatola bagnata e incubare per una notte a 4 °C.NOTA: Aggiungere una piccola quantità di acqua alla scatola bagnata per evitare l’evaporazione dell’anticorpo. Incubazione secondaria degli anticorpi: lavare le sezioni tre volte con la soluzione di PBS per 5 minuti ogni volta. Rimuovere la PBS agitando le sezioni per asciugarle, coprire il tessuto con una goccia di anticorpo secondario (HRP-label) delle specie correlate dell’anticorpo primario e incubare a RT per 50 minuti. Omogeneizzazione con 3,3′-diaminobenzidina (DAB): lavare le sezioni con soluzione di PBS tre volte per 5 minuti ciascuna. Dopo aver agitato le sezioni per asciugarle, far cadere la soluzione cromogenica DAB appena preparata sulle sezioni. Osservare il tempo di sviluppo del colore al microscopio; Il positivo è giallo-brunastro. Risciacquare con acqua di rubinetto per terminare lo sviluppo del colore. Colorare nuovamente con ematossilina per circa 1 minuto, lavare con acqua di rubinetto e poi risciacquare per 10 minuti con acqua di rubinetto per tornare al blu. Disidratazione e sigillatura:Mettere le sezioni in alcol al 75% per 5 minuti e all’85% per 5 minuti. Mettere le sezioni nell’etanolo anidro I per 5 minuti, nell’etanolo anidro II per 5 minuti e nell’etanolo anidro III per 5 minuti. Lavare le sezioni in xilene I per 5 minuti, estrarle ad asciugare leggermente e sigillare le sezioni con gomma neutra. Acquisizione delle immagini: Raccogli le immagini mediante esame microscopico e analizzale con il software halo per l’analisi delle immagini panoramiche del tessuto.NOTA: I nuclei colorati con ematossilina sono blu e l’espressione positiva di DAB è osservata come giallo-brunastra. 4. Immunofluorescenza renale delle IgA Preparare sezioni di paraffina per i reni come descritto al punto 2.1. Decerare le sezioni di paraffina:Mettere le sezioni nello xilene I per 5 minuti, nello xilene II per 5 minuti e nello xilene III per 5 minuti. Trattare le sezioni in etanolo anidro I, etanolo anidro II, etanolo al 95%, etanolo al 90%, etanolo all’80%, etanolo al 70% ed etanolo al 50%, ciascuna per 5 minuti, e lavare con acqua distillata. Recupero della proteinasi K: Agitare le sezioni per asciugarle e disegnare un cerchio attorno alla sezione di tessuto con una penna istochimica. Aggiungere la soluzione di lavoro della proteinasi K (rapporto 1:9 tra soluzione madre e PBS) goccia a goccia per coprire il tessuto e incubare a 37 °C per 30 minuti. Lavare le sezioni tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna. Penetrazione della membrana cellulare: Agitare leggermente le sezioni per asciugarle e poi coprirle con Tritone allo 0,1%. Incubare per 20 minuti a RT e lavare le sezioni tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna. Bloccante: Aggiungere il 10% di siero di capra goccia a goccia per coprire uniformemente il tessuto per il blocco a RT per 30 minuti. Incubazione primaria degli anticorpi: aggiungere una quantità appropriata di anticorpo IgA coniugato AF488 di capra (1:500) goccia per goccia per coprire il tessuto in modo uniforme e incubare per una notte a 4 °C. Colorazione dei nuclei: Lavare le fette tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere la colorazione goccia a goccia del 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) sulle sezioni e incubare per 15 minuti a RT, al riparo dalla luce. Lavare e sigillare le sezioni: lavare le sezioni tre volte con PBS per 5 minuti, quindi sigillarle con un mezzo di montaggio antisbiadimento. Microscopia e fotografia: osservare le sezioni al microscopio a fluorescenza e scattare immagini.NOTA: Per DAPI, l’eccitazione ultravioletta è la lunghezza d’onda 330-380 nm e la lunghezza d’onda di emissione è 420 nm, luce blu. La lunghezza d’onda di eccitazione dell’isotiocianato di fluoresceina (FITC) è 465-495 nm e la lunghezza d’onda di emissione è 515-555 nm, luce verde. 5. Coltura cellulare Ottieni la linea di linfociti B umani DAKIKI da ATCC, USA. Coltura di cellule DAKIKI in terreno RPMI-1640 integrato con il 10% di FBS e l’1% di penicillina-streptomicina. Coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% di CO2 e sub-coltivarle ogni 2-3 giorni. Utilizzare le cellule nella fase di crescita logaritmica per tutti gli esperimenti. Alla confluenza del 70%-80%, raccogliere le cellule con una pipetta sterile e centrifugare le cellule a 140 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante, risospendere con il terreno privo di siero e, dopo 24 ore, lasciare tutte le cellule in un periodo di quiescenza per il trattamento successivo. 6. Saggi di citotossicità LDH per lo screening di concentrazioni sicure di DIO su cellule DAKIKI normali Seminare le cellule DAKIKI in piastre a 96 pozzetti a una densità di 4×105 cellule/pozzetto e impostare un gruppo di controllo basso, un gruppo di controllo alto e diverse concentrazioni di DIO (0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 μg/mL). Incubare in incubatore al 5% di CO2, 37 °C per 24 ore dopo il trattamento corrispondente secondo il metodo di raggruppamento. Secondo le istruzioni del kit di rilevamento della citotossicità, aggiungere 5 μl di lisato per pozzetto nel gruppo di controllo alto, quindi posizionare la piastra in un incubatore al 5% di CO2, 37 °C per 15 minuti. Estrarre la piastra, aggiungere 100 μl della miscela di reazione a ciascun pozzetto, incubare al buio per 10 minuti a RT, quindi aggiungere 50 μl della soluzione di stop della reazione. Misurare il valore OD a 490 nm sul lettore di micropiastre il prima possibile. Calcolare il tasso di rilascio di LDH di diverse concentrazioni di DIO e ≤10% come dose massima somministrata secondo la formula: tasso di rilascio di LDH = (LDH sperimentale – LDH di controllo basso) / (LDH di controllo alto – LDH di controllo basso) x 100%. 7. Saggio CCK-8 per rilevare l’effetto di DIO sulla proliferazione delle cellule DAKIKI Sulla base dei risultati dei nostri precedenti esperimenti20, stabilire un modello di IgAN utilizzando LPS 40 μg/mL per indurre le cellule DAKIKI. Quindi, seminare 4×105 cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti e dividerlo nei gruppi di controllo, modello e DIO a bassa, media e alta concentrazione (0,25 μg/mL, 0,5 μg/mL e 1,0 μg/mL). Incubare le piastre in un’incubatrice al 5% di CO2, 37 °C per 24 ore. Quindi, aggiungere 20 μl di reagente CCK-8 a ciascun pozzetto e riposizionare le piastre nell’incubatore (5% CO2, 37 °C) per 2 ore. Dopo l’incubazione, rilevare il diametro esterno a una lunghezza d’onda di 450 nm sul lettore di micropiastre il prima possibile. 8. ELISA per rilevare l’effetto di DIO sulla secrezione di IgA e Gd-IgA1 da parte delle cellule DAKIKI Seminare le cellule DAKIKI in piastre a 6 pozzetti a una densità di 6×106 cellule/pozzetto, e raggruppare e trattare le cellule secondo il passaggio 7.2. Coltivare le cellule per 24 ore, quindi centrifugare a 850 x g per 10 minuti a 4 °C per ottenere il surnatante. Rilevare le concentrazioni di IgA e Gd-IgA1 secondo le istruzioni del kit. 9.qRT-PCR per rilevare l’effetto di DIO sui livelli di mRNA di C1GALT1 e Cosmc nelle cellule DAKIKI Seminare le cellule DAKIKI a una densità di 6×106 cellule/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti, raggruppare e trattare le cellule come CCK8 menzionato nel passaggio 7.2 e incubare per 24 ore. Estrarre l’RNA totale dalle cellule DAKIKI secondo le istruzioni del kit di estrazione dell’RNA totale. Dopo aver prelevato 1 μL di RNA estratto da ciascun gruppo di campioni e averne misurato la concentrazione, trascrivere inversamente 1 μg di RNA totale da ciascun campione in cDNA secondo le istruzioni del kit. Quindi, eseguire l’amplificazione RT-PCR per rilevare l’espressione di ciascun gene (95 °C per 15 minuti, 95 °C per 10 secondi e 60 °C per 30 secondi). Calcola il livello di espressione di ciascun gene utilizzando il metodo 2-ΔΔCT con β-actina come riferimento interno.NOTA: Le sequenze di primer erano le seguenti:C1GALT1: 5′-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3′, 5′-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3′;Cosmc: 5′-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3′, 5′-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3′;β-actina: 5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′, 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′. 10. Western blotting per l’esame dell’effetto di DIO sull’espressione delle proteine C1GALT1 e Cosmc nelle cellule DAKIKI Seminare le cellule DAKIKI a una densità di 6×106 cellule/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti. Raggrupparli e trattarli come indicato nel passaggio 7.2. Dopo 24 ore di incubazione, raccogliere ogni gruppo di cellule. Aggiungere una quantità adeguata di soluzione di lisi cellulare (PMSF: inibitore della fosfatasi: soluzione di lisi RIPA = 1:1:100) e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Quindi centrifugare a 13.500 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il dosaggio della concentrazione proteica BCA. Mescolare i campioni di proteine con 5 tamponi di caricamento SDS-PAGE a 4:1 mediante vortex e riscaldare i campioni misti a 100 °C per 5 minuti per denaturare la proteina. Per rilevare proteine con pesi molecolari diversi, aggiungere il marcatore proteico (5 μL/pozzetto) e i campioni (20 μg/pozzetto) in diverse corsie di un gel SDS-PAGE al 12%, eseguire l’elettroforesi SDS-PAGE e trasferire il gel sulle membrane PVDF. Bloccare le membrane con latte scremato al 5% per 2 ore a RT e incubare con gli anticorpi primari corrispondenti (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) per 24 ore. Utilizzare l’anticorpo β-actina (1:100000) come controllo interno. Lavare la membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) con 1x soluzione salina tamponata Tris, detergente Tween 20 allo 0,1% (TBST) tre volte (10 min/tempo), quindi incubare con il corrispondente anticorpo IgG secondario di capra anti-coniglio (1: 10000) a RT per 2 ore. Lavare nuovamente la membrana con TBST (tre volte per 10 minuti ciascuna) e trattarla con una quantità appropriata di soluzione di lavoro a chemiluminescenza potenziata (ECL) (secondo le istruzioni del produttore) per il rilevamento delle bande proteiche. Acquisisci le immagini utilizzando il sistema di imaging a chemiluminescenza ed esegui un’analisi semiquantitativa dei valori di grigio delle proteine utilizzando il sistema di analisi delle immagini Image J. 11. Analisi statistica Utilizzare un’applicazione software appropriata per l’analisi dei dati. Esprimi tutti i dati come mezzi ± SD (deviazione standard) e valuta più campioni mediante un test ANOVA unidirezionale per il confronto tra i gruppi.NOTA: Il software statistico SPSS 26.0 è stato utilizzato per l’analisi statistica. Il metodo LSD è stato utilizzato per confronti a due vie tra gruppi quando le varianze erano uguali, e il metodo Dunnett T3 è stato utilizzato per confronti a due vie tra gruppi quando le varianze non erano uguali. Si ritiene che P<0,05 indichi una differenza statisticamente significativa.