İn Vivo B Hücre Aktivasyonunu İnhibe Ederek ve Galaktoz Eksikliği Olan IgA1 Üretimini In Vitro Azaltarak Diosin Aracılı IgA Nefropatisinin Hafifletilmesi

Guanganmen Hastanesi etik kurulu bu deneyi onayladı (hayvan deneyi etik onay numarası: IACUC-GAMH-2023-003). 1. Farelerin deneysel prosedür için hazırlanması Hastanenin/araştırma merkezinin hayvan tesisinde 22 SPF dereceli erkek Balb/c faresi (6-7 haftalık, vücut ağırlığı 20-25 g) yetiştirin. Rastgele sayı tablosu yöntemini kullanarak hayvanları kontrol (n = 8) ve model (n = 14) gruplarına bölün. Laboratuvar kafesinde 1 haftalık adaptif yetiştirmeden sonra, model grubunu (IgAN grubu) Zou ve ark.18’in modelleme protokolüne göre 9 hafta boyunca 6 mmol/L HCl içeren asitlendirilmiş suda %0.1 sığır gama globulini (BGG) çözeltisi ile besleyin. Bir IgAN deneysel fare modeli18 hazırlamak için BGG solüsyonu içmeye devam ederken, art arda 3 gün boyunca salin içinde salin içinde 0.1 mL% 0.1 BGG solüsyonu enjekte edin. Kontrol grubunun 9 hafta boyunca BGG olmadan 6 mmol/L HCl asitlendirilmiş suyu serbestçe içmesine izin verin. Karşılık gelen hacimdeki salini art arda 3 gün boyunca kuyruk damarına enjekte edin.NOT: Kontrol ve model grupları normal yemle aynı kalitede beslenmiştir. Kuyruk damarı enjeksiyonundan sonra, kontrol grubunda 2 fare ve model grubunda 2 fareyi rastgele seçin ve modellemenin başarılı olup olmadığını belirlemek için proteinüri, ışık mikroskobu ve immünofloresan ile inceleyin.NOT: Hayvanlara yiyecek verilmemektedir, ancak suya maruz kalmaları yasak değildir; idrar çıkışını kaydedin. Metabolik kafeslerle 24 saat boyunca idrar toplayın ve 5 dakika boyunca 400 x g’da santrifüjleyin; İdrar tortusunu atın. Süpernatantın 10 kat seyreltilmesinden sonra, bir idrar proteini tahlil kiti kullanarak proteinüri konsantrasyonunu ölçün ve daha sonra 24 saat toplam idrar proteini elde etmek için seyreltme faktörü ve idrar hacmi ile çarpın.NOT: Mikroskopi ve immünofloresan yöntemleri sırasıyla bölüm 3 ve 4’te gösterilmiştir. Modeli başarılı bir şekilde hazırladıktan sonra, model grubundaki 12 fareyi, rastgele sayı tablosu yöntemine göre model grubunda (IgAN grubu) ve DIO gavaj grubunda (DIO grubu) olmak üzere 6 fareye bölün. Kontrol grubunun BGG’siz 6 mmol/L HCl asitlenmiş su içmeye devam etmesine izin verin ve model grubu 6 mmol/L HCl içeren asitlenmiş sudan oluşan %0.1’lik BGG solüsyonu. Farmakolojik deneysel metodolojinin doz dönüşüm formülüne göre DIO grubu gavaj uygulamasının dozunu hesaplayın (70 kg’lık insan vücudu kütlesine göre dönüştürülür)19. Gavaj DIO tabletleri 8 hafta boyunca günde bir kez 0.06 g / kg. 8 haftalık gavajdan sonra, fareleri intraperitoneal olarak% 0.4 pentobarbital sodyum (60 mg / kg) ile uyuşturun ve ayak parmağı tutamıyla uygun anesteziyi onayladıktan sonra, sonraki ışık mikroskobu ve immünohistokimya analizleri için böbrekleri ve Peyer yamasını izole edin.NOT: İn vivo model için şema Ek Şekil 1’dedir. 2. Histolojik analiz Böbrekler için parafin bölümleri ve Peyer yaması3 mm kalınlığındaki böbrek dokularını veya 1 Peyer yamasını 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin, gradyan etanol ve ksilen ile kurutun. 2 saat balmumuna batırın, kapatın ve dondurun. 2 μm kalınlığında böbrek kesitleri ve 4 μm kalınlığında Peyer yama kesitlerini kesin ve ılık suda yayın. Katlanmamış dilimleri temiz bir cam sürgü ile toplayın ve sabit sıcaklıktaki fırında 40 °C’de 1 saat pişirin. Numunenin ön işleminden sonra boyamaya başlayın.NOT: Böbreğin hiler kısmının koronal yüzeyini, 3 mm doku bloğu kalınlığında alın. Parafin bölümlerini oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca periyodik asit çözeltisi ile ışıktan arındırın ve boyayın. Damıtılmış su ile durulayın ve Schiff’in boyama solüsyonu ile 20-30 dakika boyunca ışıktan kaçınarak kuru-lekeli olarak silin. Mikroskop altında bölümler kırmızı olana kadar damıtılmış su ile durulayın. Bölümleri hematoksilen boyama solüsyonuna yerleştirin, çekirdekleri 3 dakika boyayın (çok derin boyanmış çekirdekler etanol hidroklorür ile bölünebilir) ve slaytlar renksiz olana kadar akan su ile durulayın. Gradyan konsantrasyonlarında etanol ve ksilen ile rutin dehidrasyon yapın, bölümleri nötr sakızla kapatın ve mikroskop altında gözlemleyin. PAS pozitif kırmızıdır ve çekirdek mavidir. 3. Peyer yamasının immünohistokimyasal analizi Peyer yamasının parafin bölümlerini adım 2.1’de açıklandığı gibi hazırlayın.NOT: İmmünohistokimyasal ve müteakip immünofloresan için bölümlerin kalınlığı 4 μm’dir. Parafin bölümlerini mumdan arındırın:Bölümleri 5 dakika ksilen I’e, 5 dakika ksilen II’ye ve 5 dakika ksilen III’e koyun. Ayrıca, slaytları susuz etanol I’de 5 dakika, susuz etanol II’de 5 dakika, alkolde 5 dakika, alkolde 5 dakika durulayın. Ardından slaytları damıtılmış suyla durulayın. Antijen alımı50x stok sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın ve kullanım için damıtılmış su ile 1x’e seyreltin. Otoklavda 2 dakika ısıtın, ardından dilimleri otoklava yerleştirin ve sıvı seviyesinin dilimlerin seviyesini aştığından emin olun. 5 dakika yüksek sıcaklıkta ısıtın, ardından slaytların doğal olarak soğumasını bekleyin. Dilimleri PBS solüsyonu ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Endojen peroksidazın bloke edilmesi: Dokunun sınırlarını immünohistokimyasal bir kalemle bir daire içinde işaretleyin. Bölümleri% 3 hidrojen peroksit çözeltisi içinde% 3 hidrojen peroksit çözeltisi içinde, RT’de 15 dakika inkübe edin, ışıktan koruyun ve bölümleri her seferinde 5 dakika PBS çözeltisi ile üç kez yıkayın. Serum blokajı: RT’de 30 dakika boyunca işaretlenen doku bölümlerine keçi serumu damlatarak bölümleri bloke edin. Bölümlerin leke ile eşit şekilde kaplandığından emin olun. Birincil antikor inkübasyonu: Bloke edici çözeltiyi yavaşça çalkalayın ve hazırlanan birincil antikorun bir kısmını ekleyin (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) bölümüne ekleyin. Kesiti düz bir şekilde ıslak bir kutuya koyun ve gece boyunca 4 °C’de inkübe edin.NOT: Antikorun buharlaşmasını önlemek için ıslak kutuya az miktarda su ekleyin. İkincil antikor inkübasyonu: Bölümleri her seferinde 5 dakika boyunca PBS solüsyonu ile üç kez yıkayın. Bölümleri kurulayarak PBS’yi çıkarın, dokuyu birincil antikorun ilgili türlerinin bir damla ikincil antikoru (HRP etiketi) ile örtün ve RT’de 50 dakika inkübe edin. 3,3′-diaminobenzidin (DAB) homojenizasyonu: Bölümleri PBS solüsyonu ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Bölümleri kuruladıktan sonra, taze hazırlanmış DAB kromojenik solüsyonunu bölümlerin üzerine bırakın. Mikroskop altında renk gelişim süresini gözlemleyin; Pozitif kahverengimsi sarıdır. Renk gelişimini sonlandırmak için musluk suyuyla durulayın. Boyama çekirdekleri: Hematoksilen ile yaklaşık 1 dakika tekrar boyayın, musluk suyuyla yıkayın ve ardından maviye dönmek için musluk suyuyla 10 dakika durulayın. Dehidrasyon ve sızdırmazlık:Bölümleri 5 dakika alkole ve 5 dakika alkole yerleştirin. Bölümleri 5 dakika susuz etanol I, 5 dakika susuz etanol II ve 5 dakika susuz etanol III içine yerleştirin. Bölümleri ksilen I’de 5 dakika yıkayın, hafifçe kuruması için çıkarın ve bölümleri nötr sakızla kapatın. Görüntü elde etme: Mikroskobik inceleme ile Görüntüleri toplayın ve dokunun panoramik görüntü analizi için halo yazılımı ile analiz edin.NOT: Hematoksilen lekeli çekirdekler mavidir ve DAB pozitif ekspresyonu kahverengimsi sarı olarak gözlenir. 4. Renal IgA immünofloresan Adım 2.1’de anlatıldığı gibi böbrekler için parafin bölümleri hazırlayın. Dewax parafin bölümleri:Bölümleri 5 dakika ksilen I’e, 5 dakika ksilen II’ye ve 5 dakika ksilen III’e koyun. Bölümleri susuz etanol I, susuz etanol II, etanol, etanol, etanol, etanol ve etanol içinde her biri 5 dakika işlemden geçirin ve damıtılmış su ile yıkayın. Proteinaz K alımı: Bölümleri kurulayın ve histokimyasal bir kalemle doku bölümünün etrafına bir daire çizin. Dokuyu kaplamak için proteinaz K çalışma solüsyonunu (1: 9 stok solüsyonu ve PBS oranı) damla damla ekleyin ve 37 ° C’de 30 dakika inkübe edin. Bölümleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Hücre zarına nüfuz etmek: Bölümleri hafifçe kurulayın ve ardından üzerlerini %0.1 Triton ile örtün. RT’de 20 dakika inkübe edin ve bölümleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Engelleme: RT’de 30 dakika boyunca bloke etmek için dokuyu eşit şekilde kaplamak için% 10 keçi serumu ekleyin. Birincil antikor inkübasyonu: Dokuyu homojen bir şekilde kaplamak için uygun miktarda keçi anti-fare AF488-konjuge IgA antikoru (1:500) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Boyama çekirdekleri: Dilimleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. PBS’yi çıkardıktan sonra, 4 “,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyasını bölümlere damla damla ekleyin ve ışıktan koruyarak RT’de 15 dakika inkübe edin. Bölümleri yıkayın ve kapatın: Bölümleri PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın, ardından bir antifade montaj ortamı ile kapatın. Mikroskopi ve fotoğrafçılık: Floresan mikroskobu altında kesitleri gözlemleyin ve görüntü alın.NOT: DAPI için ultraviyole uyarma dalga boyu 330-380 nm’dir ve emisyon dalga boyu 420 nm, mavi ışıktır. Floresein izotiyosiyanat (FITC) uyarma dalga boyu 465-495 nm’dir ve emisyon dalga boyu 515-555 nm, yeşil ışıktır. 5. Hücre kültürü ATCC, ABD’den insan B lenfosit hattı DAKIKI’yi edinin. % 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamında kültür DAKIKI hücreleri. Hücreleri 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde kültürleyin ve her 2-3 günde bir alt kültürleyin. Tüm deneyler için logaritmik büyüme aşamasındaki hücreleri kullanın. % 70 -% 80 birleşimde, hücreleri steril bir pipetle toplayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 140 x g’da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, serumsuz ortamla tekrar süspanse edin ve 24 saat sonra, sonraki tedavi için tüm hücreleri hareketsiz bir dönemde bırakın. 6. Normal DAKIKI hücrelerinde güvenli DIO konsantrasyonlarının taranması için LDH sitotoksisite testleri DAKIKI hücrelerini 96 oyuklu plakalarda 4×105 hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın ve bir Düşük kontrol grubu, bir Yüksek kontrol grubu ve farklı DIO konsantrasyonları (0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 μg / mL) ayarlayın. Gruplama yöntemine göre ilgili işlemden sonra 24 saat boyunca% 5 CO2, 37 ° C inkübatörde inkübe edin. Sitotoksisite tespit kitinin talimatlarına göre, yüksek kontrol grubundaki kuyucuk başına 5 μL lizat ekleyin ve ardından plakayı 15 dakika boyunca% 5 CO2, 37 ° C’lik bir inkübatöre yerleştirin. Plakayı çıkarın, her bir oyuğa 100 μL reaksiyon karışımı ekleyin, RT’de 10 dakika karanlıkta inkübe edin ve ardından 50 μL durdurma reaksiyonu çözeltisi ekleyin. Mikroplaka okuyucuda OD değerini 490 nm’de mümkün olan en kısa sürede ölçün. Aşağıdaki formüle göre uygulanan maksimum doz olarak farklı DIO konsantrasyonlarının LDH salım oranını ve %≤10’u hesaplayın: LDH salım oranı = (deneysel kuyu LDH – düşük kontrol LDH) / (yüksek kontrol LDH – düşük kontrol LDH) x 0. 7. DIO’nun DAKIKI hücre proliferasyonu üzerindeki etkisini tespit etmek için CCK-8 testi Önceki deneylerimizin20 sonuçlarına dayanarak, DAKIKI hücrelerini indüklemek için LPS 40 μg / mL kullanarak bir IgAN modeli oluşturun. Daha sonra, 96 oyuklu plakalarda 4×105 hücre / kuyu tohumlayın ve kontrol, model ve DIO düşük, orta ve yüksek konsantrasyon gruplarına (0.25 μg / mL, 0.5 μg / mL ve 1.0 μg / mL) bölün. Plakaları %5 CO2, 37 ° C’lik bir inkübatörde 24 saat inkübe edin. Daha sonra, her bir oyuğa 20 μL CCK-8 reaktifi ekleyin ve plakaları 2 saat boyunca inkübatöre (% 5 CO2, 37 ° C) geri yerleştirin. İnkübasyondan sonra, mikroplaka okuyucuda OD’yi mümkün olan en kısa sürede 450 nm dalga boyunda tespit edin. 8. DIO’nun DAKIKI hücreleri tarafından IgA ve Gd-IgA1 salgılanması üzerindeki etkisini tespit etmek için ELISA DAKIKI hücrelerini 6×106 hücre/kuyucuk yoğunluğunda 6 oyuklu plakalara tohumlayın ve hücreleri adım 7.2’ye göre gruplandırın ve tedavi edin. Hücreleri 24 saat kültürleyin, daha sonra süpernatanı elde etmek için 4 ° C’de 10 dakika boyunca 850 x g’da santrifüjleyin. Kit talimatlarına göre IgA ve Gd-IgA1 konsantrasyonlarını tespit edin. 9.qRT-PCR DIO’nun DAKIKI hücrelerinde C1GALT1 ve Cosmc mRNA seviyeleri üzerindeki etkisini tespit etmek için DAKIKI hücrelerini 6 oyuklu bir plakada 6×106 hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın, hücreleri adım 7.2’de belirtilen CCK8 gibi gruplandırın ve tedavi edin ve 24 saat inkübe edin. Toplam RNA ekstraksiyon kitinin talimatlarına göre DAKIKI hücrelerinden toplam RNA’yı çıkarın. Her numune grubundan 1 μL ekstrakte edilmiş RNA aldıktan ve konsantrasyonunu ölçtükten sonra, kit talimatlarına göre her numuneden 1 μg toplam RNA’yı ters olarak cDNA’ya kopyalayın. Ardından, her bir genin ekspresyonunu tespit etmek için RT-PCR amplifikasyonu gerçekleştirin (15 dakika boyunca 95 °C, 10 saniye boyunca 95 °C ve 30 saniye boyunca 60 °C). İç referans olarak β-aktin ile 2-ΔΔCT yöntemini kullanarak her bir genin ekspresyon seviyesini hesaplayın.NOT: Astar dizileri aşağıdaki gibidir:C1GALT1: 5′-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3′, 5′-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3′;Kozmik: 5′-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3′, 5′-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3′;β-aktin: 5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′, 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′. 10. DIO’nun DAKIKI hücrelerinde C1GALT1 ve Cosmc proteinlerinin ekspresyonu üzerindeki etkisini incelemek için Western blotlama DAKIKI hücrelerini 6 oyuklu bir plakada 6×106 hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın. Bunları adım 7.2’de belirtildiği gibi gruplandırın ve ele alın. 24 saatlik inkübasyondan sonra, her bir hücre grubunu toplayın. Uygun miktarda hücre lizis çözeltisi ekleyin (PMSF: fosfataz inhibitörü: RIPA lizis çözeltisi = 1: 1: 100) ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra 13.500 x g’da 4 ° C’de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın. BCA protein konsantrasyonu test kitini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Protein örneklerini 5x SDS-PAGE yükleme tamponu ile 4: 1’de girdaplama ile karıştırın ve proteini denatüre etmek için karışık örnekleri 100 ° C’de 5 dakika ısıtın. Farklı moleküler ağırlıklara sahip proteinleri tespit etmek için, protein işaretleyicisini (5 μL/kuyucuk) ve numuneleri (20 μg/kuyucuk) ‘lik bir SDS-PAGE jelin farklı şeritlerine ekleyin, SDS-PAGE elektroforezini çalıştırın ve jeli PVDF membranlarına aktarın. Membranları RT’de 2 saat boyunca% 5 yağsız sütle bloke edin ve 24 saat boyunca karşılık gelen primer antikorlarla (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) inkübe edin. Dahili kontrol olarak β-aktin antikoru (1:100000) kullanın. Poliviniliden florür (PVDF) membranını 1x Tris-Tamponlu Salin,% 0.1 Tween 20 deterjan (TBST) ile üç kez (10 dakika / saat) yıkayın, ardından karşılık gelen ikincil keçi anti-tavşan IgG antikoru (1: 10000) ile RT’de 2 saat inkübe edin. Membranı tekrar TBST ile yıkayın (her biri 10 dakika boyunca üç kez) ve protein bandı tespiti için uygun miktarda gelişmiş kemilüminesans (ECL) çalışma solüsyonu (üreticinin talimatlarına göre) ile muamele edin. Kemilüminesans görüntüleme sistemini kullanarak görüntüleri yakalayın ve Image J görüntü analiz sistemini kullanarak proteinlerin gri değerlerinin yarı kantitatif bir analizini gerçekleştirin. 11. İstatistiksel analiz Verileri analiz etmek için uygun bir yazılım uygulaması kullanın. Tüm verileri SD (standart sapma) ± ortalama olarak ifade edin ve gruplar arasında karşılaştırma yapmak için tek yönlü bir ANOVA testi ile birden fazla örneği değerlendirin.NOT: İstatistiksel analizler için SPSS istatistik programı 26.0 kullanılmıştır. Varyansların eşit olduğu durumlarda gruplar arası iki yönlü karşılaştırmalar için LSD yöntemi, varyansların eşit olmadığı durumlarda gruplar arası iki yönlü karşılaştırmalar için Dunnett T3 yöntemi kullanılmıştır. P<0.05'in istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu düşünüldü.