Concentración de partículas de virus de muestras ambientales de agua y aguas residuales mediante floculación y ultrafiltración de leche desnatada
Summary
La concentración de virus a partir de muestras ambientales de agua y aguas residuales es una tarea desafiante, llevada a cabo principalmente para la identificación y cuantificación de virus. Si bien se han desarrollado y probado varios métodos de concentración de virus, demostramos aquí la efectividad de la ultrafiltración y la floculación de leche desnatada para virus de ARN con diferentes tipos de muestras.
Abstract
La epidemiología basada en el agua y las aguas residuales ha surgido como métodos alternativos para monitorear y predecir el curso de los brotes en las comunidades. La recuperación de fracciones microbianas, incluidos virus, bacterias y microeucariotas de aguas residuales y muestras de agua ambiental es uno de los pasos desafiantes en estos enfoques. En este estudio, nos centramos en la eficiencia de recuperación de los métodos secuenciales de ultrafiltración y floculación de leche desnatada (SMF) utilizando ARN blindado como virus de prueba, que también se utiliza como control en algunos otros estudios. Se aplicó prefiltración con filtros de disco de membrana de 0,45 μm y 0,2 μm para eliminar las partículas sólidas antes de la ultrafiltración para evitar la obstrucción de los dispositivos de ultrafiltración. Las muestras de prueba, procesadas con el método de ultrafiltración secuencial, se centrifugaron a dos velocidades diferentes. Una mayor velocidad resultó en menores tasas de recuperación y positividad de ARN blindado. Por otro lado, SMF resultó en tasas de recuperación y positividad relativamente consistentes de ARN blindado. Pruebas adicionales realizadas con muestras de agua ambiental demostraron la utilidad de SMF para concentrar otras fracciones microbianas. La partición de los virus en partículas sólidas podría tener un impacto en las tasas generales de recuperación, teniendo en cuenta el paso de prefiltración aplicado antes de la ultrafiltración de muestras de aguas residuales. SMF con prefiltración funcionó mejor cuando se aplicó a muestras de agua ambiental debido a las concentraciones de sólidos más bajas en las muestras y, por lo tanto, a las tasas de partición más bajas a sólidos. En el presente estudio, la idea de utilizar un método de ultrafiltración secuencial surgió de la necesidad de disminuir el volumen final de los concentrados virales durante la pandemia de COVID-19, cuando el suministro de los dispositivos de ultrafiltración comúnmente utilizados era limitado, y existía la necesidad del desarrollo de métodos alternativos de concentración viral.
Introduction
La determinación de la concentración efectiva de microorganismos en muestras de superficie y aguas residuales para análisis de comunidades microbianas y estudios epidemiológicos, es uno de los pasos importantes para monitorear y predecir el curso de los brotes en las comunidades 1,2. La pandemia de COVID-19, puso de manifiesto la importancia de mejorar los métodos de concentración. COVID-19 surgió a fines de 2019 y, a partir de marzo de 2023, todavía representa una amenaza para la salud humana, la vida social y la economía. Las estrategias efectivas de vigilancia y control para aliviar los impactos de los brotes de COVID-19 en las comunidades se han convertido en un importante tema de investigación, ya que han surgido nuevas olas y variantes de COVID-19, además de la rápida transmisión y propagación del virus, así como casos asintomáticos no notificados y no diagnosticados 3,4,5. El uso de la epidemiología basada en las aguas residuales para COVID-19 por parte de organizaciones de la sociedad civil, agencias gubernamentales y servicios públicos o privados ha sido útil para proporcionar información rápida relacionada con el brote y mitigar los impactos de los brotes de COVID-19 6,7,8,9. Sin embargo, la concentración de SARS-CoV-2, un virus de ARN envuelto, en muestras de aguas residuales todavía plantea desafíos10. Por ejemplo, uno de estos desafíos es la partición del SARS-CoV-2 en los sólidos de aguas residuales, lo que puede afectar la recuperación cuando los sólidos se eliminan durante la concentración11. Si este es el caso, el enfoque de la cuantificación / evaluación debe estar en las fases sólida y acuosa de las muestras de agua ambiental, en lugar de la fase acuosa solamente. Además, la elección del método de concentración puede modificarse en función de ensayos y análisis posteriores. La concentración de partículas de virus y patógenos de muestras ambientales se ha convertido en un tema de investigación urgente con desarrollos en los campos de secuenciación y microbioma.
Se han aplicado varios métodos de concentración de virus en el campo de la concentración de virus a partir de muestras ambientales de agua y aguas residuales. Algunos métodos comúnmente utilizados son la filtración, la floculación de leche desnatada (SMF), la adsorción/elución y la precipitación de polietilenglicol12-17. Entre ellos, SMF ha sido considerado un método barato y eficaz, probado con éxito y aplicado para recuperar virus, incluido el SARS-CoV-2, de aguas residuales y superficiales12,15,16,18. El procedimiento SMF es un enfoque relativamente nuevo que ha ganado un mayor reconocimiento entre muchos estudios ambientales como una metodología apropiada para recuperar simultáneamente una amplia gama de microorganismos como virus, bacterias y protozoos de todo tipo de muestras de agua, a saber, lodos, aguas residuales sin tratar, aguas residuales y muestras de efluentes19. En comparación con otras metodologías conocidas para recuperar virus de muestras ambientales como la ultrafiltración y la elución glicina-alcalina, el enfoque basado en la liofilización o la ultracentrifugación y la elución glicina-alcalina, la SMF ha sido reportada como el método más eficiente con mayores tasas de recuperación y detección viral18,20. En el presente estudio, utilizamos ARN blindado como virus de prueba para evaluar la eficiencia de recuperación de los métodos de concentración del virus, incluidas las pruebas para evaluar la recuperación del SARS-CoV-221,22.
Aquí, probamos muestras de aguas residuales y agua ambiental para demostrar la utilidad de SMF y un método de ultrafiltración secuencial para concentrar fracciones microbianas para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), la metagenómica basada en secuencias y la secuenciación de amplicones profundos. SMF es un método relativamente más barato y óptimo para un mayor volumen de muestras en comparación con los métodos de ultrafiltración. La idea de utilizar un método de ultrafiltración secuencial surgió de la necesidad de disminuir el volumen final de los concentrados virales durante la pandemia de COVID-19, cuando el suministro de los dispositivos de ultrafiltración de uso común era limitado, y existía la necesidad de desarrollar métodos alternativos de concentración viral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno de los pasos críticos en este estudio es la eliminación de partículas sólidas mediante la aplicación de un paso de prefiltración con filtros de membrana de 0,2 μm y 0,45 μm. Considerando la partición de los virus en partículas sólidas, especialmente los virus envueltos, la prefiltración puede causar una pérdida significativa en la recuperación viral30. Si bien un paso de prefiltración para los métodos de ultrafiltración casi siempre es necesario para las muestras ambientales y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NSERC Alliance Covid-19 Grant (Premio No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan y Uyaguari-Díaz). MUD desea agradecer al Programa de Becas de Investigación Universitaria (Premio No. 325201). Tanto JF como JZA cuentan con el apoyo del programa de capacitación de posgrado Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY y JF recibieron becas del programa Mitacs Accelerate. MUD y los miembros de su laboratorio (KY, JF, JZA) cuentan con el apoyo de NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) y la subvención Research Manitoba New Investigator Operating (No 5385). Un agradecimiento especial a la ciudad de Winnipeg, Manitoba. Esta investigación se llevó a cabo en la Universidad de Manitoba. Nos gustaría reconocer que los campus de la Universidad de Manitoba están ubicados en las tierras originales de los pueblos Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota y Dene y en la patria de la Nación Métis.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
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