Concentratie van virusdeeltjes uit milieuwater- en afvalwatermonsters met behulp van magere melkflocculatie en ultrafiltratie
Summary
Virusconcentratie uit milieuwater- en afvalwatermonsters is een uitdagende taak, voornamelijk uitgevoerd voor de identificatie en kwantificering van virussen. Hoewel er verschillende virusconcentratiemethoden zijn ontwikkeld en getest, tonen we hier de effectiviteit aan van ultrafiltratie en magere melkvlokking voor RNA-virussen met verschillende monstertypen.
Abstract
Op water en afvalwater gebaseerde epidemiologie zijn naar voren gekomen als alternatieve methoden om het verloop van uitbraken in gemeenschappen te volgen en te voorspellen. Het terugwinnen van microbiële fracties, waaronder virussen, bacteriën en microeukaryoten uit afvalwater en milieuwatermonsters is een van de uitdagende stappen in deze benaderingen. In deze studie hebben we ons gericht op de herstelefficiëntie van sequentiële ultrafiltratie en magere melk flocculatie (SMF) -methoden met behulp van gepantserd RNA als een testvirus, dat ook wordt gebruikt als een controle door sommige andere studies. Voorfiltratie met 0,45 μm en 0,2 μm membraanschijffilters werden toegepast om vaste deeltjes te elimineren vóór ultrafiltratie om de verstopping van ultrafiltratie-apparaten te voorkomen. Testmonsters, verwerkt met de sequentiële ultrafiltratiemethode, werden met twee verschillende snelheden gecentrifugeerd. Een verhoogde snelheid resulteerde in lagere herstel- en positiviteitspercentages van gepantserd RNA. Aan de andere kant resulteerde SMF in relatief consistente herstel- en positiviteitspercentages van gepantserd RNA. Aanvullende tests uitgevoerd met milieuwatermonsters toonden het nut aan van SMF om andere microbiële fracties te concentreren. De verdeling van virussen in vaste deeltjes kan van invloed zijn op de algehele terugwinningspercentages, gezien de voorfiltratiestap die wordt toegepast vóór de ultrafiltratie van afvalwatermonsters. SMF met voorfiltratie presteerde beter wanneer toegepast op milieuwatermonsters vanwege lagere vaste concentraties in de monsters en dus lagere verdelingssnelheden naar vaste stoffen. In de huidige studie ontstond het idee om een sequentiële ultrafiltratiemethode te gebruiken uit de noodzaak om het uiteindelijke volume van de virale concentraten te verminderen tijdens de COVID-19-pandemie, toen het aanbod van de veelgebruikte ultrafiltratie-apparaten beperkt was en er behoefte was aan de ontwikkeling van alternatieve virale concentratiemethoden.
Introduction
Het bepalen van de effectieve concentratie van micro-organismen in oppervlakte- en afvalwatermonsters voor microbiële gemeenschapsanalyse en epidemiologische studies, is een van de belangrijke stappen voor het monitoren en voorspellen van het verloop van uitbraken in gemeenschappen 1,2. De COVID-19-pandemie ontvouwde het belang van het verbeteren van concentratiemethoden. COVID-19 dook eind 2019 op en vormt vanaf maart 2023 nog steeds een bedreiging voor de menselijke gezondheid, het sociale leven en de economie. Effectieve surveillance- en controlestrategieën om de gevolgen van COVID-19-uitbraken in gemeenschappen te verlichten, zijn een belangrijk onderzoeksonderwerp geworden, aangezien nieuwe golven en varianten van COVID-19 zijn ontstaan naast de snelle overdracht en verspreiding van het virus, evenals niet-gemelde en niet-gediagnosticeerde asymptomatische gevallen 3,4,5. Het gebruik van op afvalwater gebaseerde epidemiologie voor COVID-19 door maatschappelijke organisaties, overheidsinstanties en openbare of particuliere nutsbedrijven is nuttig geweest bij het verstrekken van snelle uitbraakgerelateerde informatie en het beperken van de gevolgen van COVID-19-uitbraken 6,7,8,9. De concentratie van SARS-CoV-2, een omhuld RNA-virus, in afvalwatermonsters vormt echter nog steeds een uitdaging10. Een van deze uitdagingen is bijvoorbeeld de verdeling van SARS-CoV-2 in vaste stoffen in afvalwater, wat van invloed kan zijn op het herstel wanneer de vaste stoffen worden geëlimineerd tijdens concentratie11. Als dit het geval is, moet de kwantificering/beoordeling gericht zijn op zowel vaste als waterige fasen van milieuwatermonsters, in plaats van alleen op de waterige fase. Bovendien kan de keuze van de concentratiemethode worden gewijzigd op basis van downstreamtests en -analyses. De concentratie van virusdeeltjes en pathogenen uit omgevingsmonsters is een urgent onderzoeksonderwerp geworden met ontwikkelingen op het gebied van sequencing en microbioom.
Op het gebied van virusconcentratie uit omgevingswater- en afvalwatermonsters zijn verschillende virusconcentratiemethoden toegepast. Enkele veelgebruikte methoden zijn filtratie, magere melkflocculatie (SMF), adsorptie / elutie en polyethyleenglycolprecipitatie12-17. Onder hen is SMF beschouwd als een goedkope en effectieve methode, met succes getest en toegepast voor het herstellen van virussen, waaronder SARS-CoV-2, uit afvalwater en oppervlaktewateren12,15,16,18. De SMF-procedure is een relatief nieuwe benadering die in veel milieustudies steeds meer erkenning heeft gekregen als een geschikte methode om tegelijkertijd een breed scala aan micro-organismen zoals virussen, bacteriën en protozoën terug te winnen uit alle soorten watermonsters, namelijk slib, ruw afvalwater, afvalwater en effluentmonsters19. In vergelijking met andere bekende methoden om virussen te herstellen uit omgevingsmonsters zoals ultrafiltratie en glycine-alkalische elutie, op lyofilisatie gebaseerde benadering of ultracentrifugatie en glycine-alkalische elutie, is SMF gerapporteerd als de meest efficiënte methode met hogere virale herstel- en detectiepercentages18,20. In de huidige studie gebruikten we gepantserd RNA als testvirus om de herstelefficiëntie van virusconcentratiemethoden te beoordelen, inclusief tests voor het beoordelen van SARS-CoV-2-herstel21,22.
Hier hebben we afvalwater- en milieuwatermonsters getest om het nut van SMF aan te tonen en een sequentiële ultrafiltratiemethode om microbiële fracties te concentreren voor kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), sequentiegebaseerde metagenomica en diepe ampliconsequencing. SMF is een relatief goedkopere methode en optimaal voor een groter volume monsters in vergelijking met ultrafiltratiemethoden. Het idee om een sequentiële ultrafiltratiemethode te gebruiken, kwam voort uit de noodzaak om het uiteindelijke volume van de virale concentraten te verminderen tijdens de COVID-19-pandemie, toen het aanbod van de veelgebruikte ultrafiltratie-apparaten beperkt was en er behoefte was aan de ontwikkeling van alternatieve virale concentratiemethoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een van de kritische stappen in deze studie is de eliminatie van vaste deeltjes door het toepassen van een voorfiltratiestap met membraanfilters van 0,2 μm en 0,45 μm. Gezien de verdeling van virussen in vaste deeltjes, met name omhulde virussen, kan voorfiltratie een aanzienlijk verlies in viraal herstel veroorzaken30. Hoewel een voorfiltratiestap voor ultrafiltratiemethoden bijna altijd nodig is voor milieu- en afvalwatermonsters om te voorkomen dat ultrafiltratie-apparaten verstopt raken, kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NSERC Alliance Covid-19 Grant (Award No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan en Uyaguari-Díaz). MUD wil graag het University Research Grants Program (Award No. 325201) bedanken. Zowel JF als JZA worden ondersteund door het Visual and Automated Disease Analytics (VADA) graduate trainingsprogramma. KY en JF ontvingen beide beurzen van het Mitacs Accelerate-programma. MUD en zijn laboratoriumleden (KY, JF, JZA) worden ondersteund door NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) en de Research Manitoba New Investigator Operating grant (nr. 5385). Speciale dank aan de stad Winnipeg, Manitoba. Dit onderzoek werd uitgevoerd aan de Universiteit van Manitoba. We willen graag erkennen dat de campussen van de Universiteit van Manitoba zich bevinden op de oorspronkelijke landen van Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota en Dene-volkeren en op het thuisland van de Métis Nation.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
References
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
- Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
- Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
- Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
- Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
- Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
- Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
- Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
- Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
- Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
- Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
- Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
- Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
- Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
- Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
- Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
- Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
- Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
- Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
- Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
- Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
- Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
- Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
- . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
- Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
- Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
- Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
- Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).
