تركيز جزيئات الفيروس من عينات المياه البيئية ومياه الصرف الصحي باستخدام تلبد الحليب منزوع الدسم والترشيح الفائق
Summary
يعد تركيز الفيروس من عينات المياه البيئية ومياه الصرف الصحي مهمة صعبة ، يتم تنفيذها في المقام الأول لتحديد الفيروسات وقياسها. بينما تم تطوير واختبار العديد من طرق تركيز الفيروس ، فإننا نوضح هنا فعالية الترشيح الفائق وتلبد الحليب منزوع الدسم لفيروسات الحمض النووي الريبي بأنواع مختلفة من العينات.
Abstract
وقد برزت الوبائيات القائمة على المياه ومياه الصرف الصحي كطرق بديلة لرصد مسار الفاشيات في المجتمعات المحلية والتنبؤ به. يعد استرداد الكسور الميكروبية ، بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا وحقيقيات النوى الدقيقة من عينات مياه الصرف الصحي والمياه البيئية ، إحدى الخطوات الصعبة في هذه الأساليب. في هذه الدراسة ، ركزنا على كفاءة استرداد طرق الترشيح الفائق المتسلسل وتلبد الحليب منزوع الدسم (SMF) باستخدام الحمض النووي الريبي المدرع كفيروس اختبار ، والذي يستخدم أيضا كعنصر تحكم من قبل بعض الدراسات الأخرى. تم تطبيق الترشيح المسبق باستخدام مرشحات قرصية غشائية 0.45 ميكرومتر و 0.2 ميكرومتر للتخلص من الجسيمات الصلبة قبل الترشيح الفائق لمنع انسداد أجهزة الترشيح الفائق. تم طرد عينات الاختبار ، التي تمت معالجتها بطريقة الترشيح الفائق المتسلسل ، بسرعتين مختلفتين. أدت السرعة المتزايدة إلى انخفاض معدلات الاسترداد والإيجابية للحمض النووي الريبي المدرع. من ناحية أخرى ، أدى SMF إلى معدلات استرداد وإيجابية متسقة نسبيا للحمض النووي الريبي المدرع. أظهرت الاختبارات الإضافية التي أجريت على عينات المياه البيئية فائدة SMF لتركيز الأجزاء الميكروبية الأخرى. قد يكون لتقسيم الفيروسات إلى جزيئات صلبة تأثير على معدلات الاسترداد الإجمالية ، مع الأخذ في الاعتبار خطوة الترشيح المسبق المطبقة قبل الترشيح الفائق لعينات مياه الصرف الصحي. كان أداء SMF مع الترشيح المسبق أفضل عند تطبيقه على عينات المياه البيئية بسبب انخفاض تركيزات المواد الصلبة في العينات وبالتالي انخفاض معدلات التقسيم إلى المواد الصلبة. في الدراسة الحالية ، نشأت فكرة استخدام طريقة الترشيح الفائق المتسلسل من ضرورة تقليل الحجم النهائي للمركزات الفيروسية أثناء جائحة COVID-19 ، عندما كان المعروض من أجهزة الترشيح الفائق شائعة الاستخدام محدودا ، وكانت هناك حاجة لتطوير طرق تركيز فيروسية بديلة.
Introduction
يعد تحديد التركيز الفعال للكائنات الحية الدقيقة في عينات المياه السطحية ومياه الصرف الصحي لتحليل المجتمع الميكروبي ودراسات علم الأوبئة ، إحدى الخطوات المهمة لرصد مسار الفاشيات في المجتمعات 1,2 والتنبؤ بها. كشفت جائحة COVID-19 عن أهمية تحسين طرق التركيز. ظهر COVID-19 في أواخر عام 2019 ، وحتى مارس 2023 ، لا يزال يشكل تهديدا لصحة الإنسان والحياة الاجتماعية والاقتصاد. أصبحت استراتيجيات الترصد والمكافحة الفعالة للتخفيف من آثار تفشي COVID-19 في المجتمعات موضوعا بحثيا مهما ، حيث ظهرت موجات ومتغيرات جديدة من COVID-19 بالإضافة إلى الانتقال السريع للفيروس وانتشاره ، وكذلك الحالات التي لا تظهر عليها أعراض والتي لم يتم الإبلاغ عنها وغير المشخصة3،4،5. كان استخدام علم الأوبئة القائم على مياه الصرف الصحي ل COVID-19 من قبل منظمات المجتمع المدني والوكالات الحكومية والمرافق العامة أو الخاصة مفيدا في توفير المعلومات السريعة المتعلقة بالتفشي والتخفيف من آثار تفشي COVID-196،7،8،9. ومع ذلك ، فإن تركيز SARS-CoV-2 ، وهو فيروس RNA مغلف ، في عينات مياه الصرف الصحي لا يزال يشكل تحديات10. على سبيل المثال ، يتمثل أحد هذه التحديات في تقسيم SARS-CoV-2 في المواد الصلبة لمياه الصرف الصحي ، مما قد يؤثر على الاسترداد عندما يتم التخلص من المواد الصلبة أثناء التركيز11. وإذا كان هذا هو الحال، ينبغي أن يكون تركيز القياس الكمي/التقييم على كل من المراحل الصلبة والمائية لعينات المياه البيئية، بدلا من المرحلة المائية فقط. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل اختيار طريقة التركيز بناء على الاختبارات والتحليلات النهائية. أصبح تركيز جزيئات الفيروس ومسببات الأمراض من العينات البيئية موضوعا بحثيا عاجلا مع التطورات في مجالات التسلسل والميكروبيوم.
تم تطبيق طرق تركيز الفيروسات المختلفة في مجال تركيز الفيروس من عينات المياه البيئية ومياه الصرف الصحي. بعض الطرق الشائعة الاستخدام هي الترشيح ، تلبد الحليب منزوع الدسم (SMF) ، الامتزاز / الشطف ، وترسيب البولي إيثيلين جلايكول12-17. من بينها ، تم اعتبار SMF طريقة رخيصة وفعالة ، وتم اختبارها بنجاح ، وتطبيقها لاستعادة الفيروسات ، بما في ذلك SARS-CoV-2 ، من مياه الصرف الصحي والمياه السطحية12،15،16،18. يعد إجراء SMF نهجا جديدا نسبيا اكتسب اعترافا متزايدا بين العديد من الدراسات البيئية كمنهجية مناسبة لاستعادة مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة في وقت واحد مثل الفيروسات والبكتيريا والأوليات من جميع أنواع عينات المياه ، وهي الحمأة ومياه الصرف الصحي الخام ومياه الصرف الصحي وعينات النفايات السائلة19. عند مقارنتها بالمنهجيات الأخرى المعروفة لاستعادة الفيروسات من العينات البيئية مثل الترشيح الفائق وشطف الجلايسين القلوي ، أو النهج القائم على التجفيد ، أو الطرد المركزي الفائق وشطف الجلايسين القلوي ، تم الإبلاغ عن SMF باعتبارها الطريقة الأكثر فعالية مع ارتفاع معدلات التعافي والكشف الفيروسي18,20. في هذه الدراسة ، استخدمنا الحمض النووي الريبي المدرع كفيروس اختبار لتقييم كفاءة استرداد طرق تركيز الفيروس ، بما في ذلك اختبارات تقييم استرداد SARS-CoV-221,22.
هنا ، اختبرنا عينات مياه الصرف الصحي والمياه البيئية لإثبات فائدة SMF وطريقة الترشيح الفائق المتسلسل لتركيز الكسور الميكروبية لتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) ، والميتاجينوميات القائمة على التسلسل ، وتسلسل الأمبليكون العميق. SMF هي طريقة أرخص نسبيا ومثالية لحجم أكبر من العينات مقارنة بطرق الترشيح الفائق. نشأت فكرة استخدام طريقة الترشيح الفائق المتسلسل من ضرورة تقليل الحجم النهائي للمركزات الفيروسية أثناء جائحة COVID-19 ، عندما كان المعروض من أجهزة الترشيح الفائق شائعة الاستخدام محدودا ، وكانت هناك حاجة لتطوير طرق تركيز فيروسية بديلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذه الدراسة في التخلص من الجسيمات الصلبة من خلال تطبيق خطوة الترشيح المسبق مع مرشحات غشائية 0.2 ميكرومتر و 0.45 ميكرومتر. بالنظر إلى تقسيم الفيروسات إلى جزيئات صلبة ، وخاصة الفيروسات المغلفة ، يمكن أن يسبب الترشيح المسبق خسارة كبيرة في الانتعاش الفيروسي<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل NSERC Alliance Covid-19 Grant (الجائزة رقم 431401363 ، 2020-2021 ، Drs. Yuan و Uyaguari-Díaz). تود MUD أن تشكر برنامج المنح البحثية الجامعية (الجائزة رقم 325201). يتم دعم كل من JF و JZA من خلال برنامج تدريب الخريجين لتحليلات الأمراض البصرية والآلية (VADA). حصل كل من KY و JF على زمالات من برنامج Mitacs Accelerate. يتم دعم MUD وأعضاء مختبره (KY ، JF ، JZA) من قبل NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) ومنحة تشغيل الباحث الجديد في مانيتوبا (رقم 5385). شكر خاص لمدينة وينيبيغ ، مانيتوبا. تم إجراء هذا البحث في جامعة مانيتوبا. نود أن نعترف بأن حرم جامعة مانيتوبا يقع على الأراضي الأصلية لشعوب Anishinaabeg و Cree و Oji-Cree و Dakota و Dene وعلى موطن أمة Métis.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
References
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
- Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
- Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
- Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
- Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
- Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
- Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
- Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
- Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
- Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
- Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
- Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
- Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
- Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
- Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
- Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
- Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
- Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
- Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
- Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
- Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
- Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
- Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
- . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
- Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
- Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
- Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
- Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).
