Konzentration von Viruspartikeln aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt mittels Magermilchflockung und Ultrafiltration
Summary
Die Viruskonzentration aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt ist eine anspruchsvolle Aufgabe, die vor allem zur Identifizierung und Quantifizierung von Viren durchgeführt wird. Während mehrere Methoden zur Viruskonzentration entwickelt und getestet wurden, demonstrieren wir hier die Wirksamkeit der Ultrafiltration und der Magermilchflockung für RNA-Viren mit verschiedenen Probentypen.
Abstract
Die wasser- und abwasserbasierte Epidemiologie hat sich als alternative Methode zur Überwachung und Vorhersage des Verlaufs von Ausbrüchen in Gemeinden herausgestellt. Die Rückgewinnung mikrobieller Fraktionen, einschließlich Viren, Bakterien und Mikroeukaryoten, aus Abwasser- und Umweltwasserproben ist einer der herausfordernden Schritte bei diesen Ansätzen. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Rückgewinnungseffizienz von sequenziellen Ultrafiltrations- und Magermilchflockungsmethoden (SMF) unter Verwendung von gepanzerter RNA als Testvirus, das auch von einigen anderen Studien als Kontrolle verwendet wird. Die Vorfiltration mit 0,45 μm und 0,2 μm Membranscheibenfiltern wurde eingesetzt, um Feststoffpartikel vor der Ultrafiltration zu eliminieren und ein Verstopfen der Ultrafiltrationsgeräte zu verhindern. Testproben, die mit der sequentiellen Ultrafiltrationsmethode verarbeitet wurden, wurden mit zwei verschiedenen Geschwindigkeiten zentrifugiert. Eine erhöhte Geschwindigkeit führte zu niedrigeren Wiederfindungs- und Positivitätsraten von gepanzerter RNA. Auf der anderen Seite führte SMF zu relativ konsistenten Wiederfindungs- und Positivitätsraten von gepanzerter RNA. Zusätzliche Tests, die mit Wasserproben aus der Umwelt durchgeführt wurden, zeigten den Nutzen von SMF zur Konzentration anderer mikrobieller Fraktionen. Die Aufteilung von Viren in feste Partikel kann sich auf die Gesamtrückgewinnungsraten auswirken, wenn man den Vorfiltrationsschritt berücksichtigt, der vor der Ultrafiltration von Abwasserproben durchgeführt wird. SMF mit Vorfiltration schnitt bei der Anwendung auf Umweltwasserproben aufgrund geringerer Feststoffkonzentrationen in den Proben und damit geringerer Aufteilungsraten in Feststoffe besser ab. In der vorliegenden Studie entstand die Idee, ein sequentielles Ultrafiltrationsverfahren zu verwenden, aus der Notwendigkeit, das Endvolumen der Viruskonzentrate während der COVID-19-Pandemie zu verringern, als das Angebot an den üblicherweise verwendeten Ultrafiltrationsgeräten begrenzt war und die Entwicklung alternativer Viruskonzentrationsmethoden erforderlich war.
Introduction
Die Bestimmung der effektiven Konzentration von Mikroorganismen in Oberflächen- und Abwasserproben für die Analyse mikrobieller Gemeinschaften und epidemiologische Studien ist einer der wichtigsten Schritte zur Überwachung und Vorhersage des Verlaufs von Ausbrüchen in Gemeinschaften 1,2. Die COVID-19-Pandemie hat gezeigt, wie wichtig es ist, die Konzentrationsmethoden zu verbessern. COVID-19 trat Ende 2019 auf und stellt im März 2023 immer noch eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit, das soziale Leben und die Wirtschaft dar. Wirksame Überwachungs- und Kontrollstrategien zur Abmilderung der Auswirkungen von COVID-19-Ausbrüchen in Gemeinschaften sind zu einem wichtigen Forschungsthema geworden, da neben der schnellen Übertragung und Ausbreitung des Virus auch neue Wellen und Varianten von COVID-19 sowie nicht gemeldete und nicht diagnostizierte asymptomatische Fälle aufgetaucht sind 3,4,5. Der Einsatz der abwasserbasierten Epidemiologie für COVID-19 durch zivilgesellschaftliche Organisationen, Regierungsbehörden und öffentliche oder private Versorgungsunternehmen hat sich als hilfreich erwiesen, um schnelle Informationen über den Ausbruch bereitzustellen und die Auswirkungen von COVID-19-Ausbrüchen abzumildern 6,7,8,9. Die Konzentration von SARS-CoV-2, einem behüllten RNA-Virus, in Abwasserproben stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderungdar 10. Eine dieser Herausforderungen ist beispielsweise die Aufteilung von SARS-CoV-2 in Abwasserfeststoffen, was sich auf die Rückgewinnung auswirken kann, wenn die Feststoffe während der Konzentration11 eliminiert werden. Wenn dies der Fall ist, sollte der Schwerpunkt der Quantifizierung/Bewertung sowohl auf der festen als auch auf der wässrigen Phase von Umweltwasserproben liegen und nicht nur auf der wässrigen Phase. Darüber hinaus kann die Wahl der Konzentrationsmethode auf der Grundlage nachgelagerter Tests und Analysen modifiziert werden. Die Konzentration von Viruspartikeln und Krankheitserregern aus Umweltproben ist mit Entwicklungen in den Bereichen Sequenzierung und Mikrobiom zu einem dringenden Forschungsthema geworden.
Im Bereich der Viruskonzentration aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt wurden verschiedene Methoden der Viruskonzentration angewendet. Einige häufig verwendete Methoden sind Filtration, Magermilchflockung (SMF), Adsorption/Elution und Polyethylenglykolfällung12-17. Unter ihnen wurde SMF als kostengünstige und effektive Methode angesehen, erfolgreich getestet und zur Gewinnung von Viren, einschließlich SARS-CoV-2, aus Abwasser und Oberflächengewässern eingesetzt 12,15,16,18. Das SMF-Verfahren ist ein relativ neuer Ansatz, der in vielen Umweltstudien zunehmend als geeignete Methode zur gleichzeitigen Gewinnung eines breiten Spektrums von Mikroorganismen wie Viren, Bakterien und Protozoen aus allen Arten von Wasserproben, nämlich Schlamm, Rohabwasser, Abwasser und Abwasserproben, anerkannt wurde19. Im Vergleich zu anderen bekannten Methoden zur Rückgewinnung von Viren aus Umweltproben wie Ultrafiltration und Glycin-Alkali-Elution, Lyophilisations-basierter Ansatz oder Ultrazentrifugation und Glycin-Alkali-Elution wurde SMF als die effizienteste Methode mit höheren viralen Rückgewinnungs- und Nachweisraten beschrieben18,20. In der vorliegenden Studie haben wir gepanzerte RNA als Testvirus verwendet, um die Rückgewinnungseffizienz von Viruskonzentrationsmethoden zu bewerten, einschließlich Tests zur Bewertung der SARS-CoV-2-Erholung21,22.
Hier testeten wir Abwasser- und Umweltwasserproben, um den Nutzen von SMF und einer sequentiellen Ultrafiltrationsmethode zur Konzentration mikrobieller Fraktionen für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), sequenzbasierte Metagenomik und Deep-Amplicon-Sequenzierung zu demonstrieren. SMF ist eine relativ kostengünstigere Methode und im Vergleich zu Ultrafiltrationsmethoden optimal für ein größeres Probenvolumen. Die Idee, ein sequentielles Ultrafiltrationsverfahren zu verwenden, entstand aus der Notwendigkeit, das Endvolumen der Viruskonzentrate während der COVID-19-Pandemie zu verringern, als das Angebot an den üblicherweise verwendeten Ultrafiltrationsgeräten begrenzt war und die Entwicklung alternativer Viruskonzentrationsmethoden erforderlich war.
Protocol
Representative Results
Discussion
Einer der entscheidenden Schritte in dieser Studie ist die Eliminierung von Feststoffpartikeln durch Anwendung eines Vorfiltrationsschritts mit 0,2 μm und 0,45 μm Membranfiltern. In Anbetracht der Aufteilung von Viren in feste Partikel, insbesondere behüllte Viren, kann die Vorfiltration zu einem erheblichen Verlust der Viruserholung führen30. Während bei Umwelt- und Abwasserproben fast immer ein Vorfiltrationsschritt für Ultrafiltrationsmethoden erforderlich ist, um ein Verstopfen von Ultra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den NSERC Alliance Covid-19 Grant (Award No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan und Uyaguari-Díaz) unterstützt. MUD bedankt sich beim Forschungsstipendienprogramm der Universität (Auszeichnung Nr. 325201). Sowohl JF als auch JZA werden durch das Graduiertenausbildungsprogramm Visual and Automated Disease Analytics (VADA) unterstützt. KY und JF erhielten beide Stipendien aus dem Mitacs Accelerate-Programm. MUD und seine Labormitglieder (KY, JF, JZA) werden von NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) und dem Research Manitoba New Investigator Operating Grant (Nr. 5385) unterstützt. Besonderer Dank geht an die Stadt Winnipeg, Manitoba. Diese Forschung wurde an der University of Manitoba durchgeführt. Wir möchten anerkennen, dass sich der Campus der University of Manitoba auf dem ursprünglichen Land der Anishinaabeg-, Cree-, Oji-Cree-, Dakota- und Dene-Völker und auf dem Heimatland der Métis-Nation befindet.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
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