Concentração de Partículas de Vírus de Amostras Ambientais de Água e Efluentes Usando Floculação e Ultrafiltração de Leite Desnatado
Summary
A concentração de vírus a partir de amostras ambientais de água e efluentes é uma tarefa desafiadora, realizada principalmente para a identificação e quantificação de vírus. Embora vários métodos de concentração viral tenham sido desenvolvidos e testados, demonstramos aqui a eficácia da ultrafiltração e floculação de leite desnatado para vírus de RNA com diferentes tipos de amostras.
Abstract
A epidemiologia baseada em água e esgoto tem emergido como métodos alternativos para monitorar e prever o curso de surtos em comunidades. A recuperação de frações microbianas, incluindo vírus, bactérias e microeucariotos de amostras de águas residuárias e ambientais é uma das etapas desafiadoras nessas abordagens. Neste estudo, focamos na eficiência de recuperação dos métodos de ultrafiltração sequencial e floculação de leite desnatado (FMS) usando RNA blindado como vírus teste, que também é usado como controle por alguns outros estudos. A pré-filtração com filtros de disco de membrana de 0,45 μm e 0,2 μm foi aplicada para eliminar partículas sólidas antes da ultrafiltração para evitar o entupimento dos dispositivos de ultrafiltração. As amostras-teste, processadas pelo método de ultrafiltração sequencial, foram centrifugadas em duas velocidades diferentes. Uma maior velocidade resultou em menores taxas de recuperação e positividade do RNA blindado. Por outro lado, a FME resultou em taxas de recuperação e positividade relativamente consistentes do RNA blindado. Testes adicionais realizados com amostras de água ambientais demonstraram a utilidade da FME para concentrar outras frações microbianas. A partição de vírus em partículas sólidas pode ter um impacto nas taxas gerais de recuperação, considerando a etapa de pré-filtração aplicada antes da ultrafiltração de amostras de águas residuais. A FME com pré-filtração apresentou melhor desempenho quando aplicada em amostras de água ambientais devido às menores concentrações de sólidos nas amostras e, portanto, menores taxas de partição para sólidos. No presente estudo, a ideia de usar um método de ultrafiltração sequencial surgiu da necessidade de diminuir o volume final dos concentrados virais durante a pandemia de COVID-19, quando o fornecimento dos dispositivos de ultrafiltração comumente usados era limitado, e havia uma necessidade para o desenvolvimento de métodos alternativos de concentração viral.
Introduction
A determinação da concentração efetiva de microrganismos em amostras de águas superficiais e residuárias para análise de comunidades microbianas e estudos epidemiológicos é uma das etapas importantes para monitorar e prever o curso de surtos em comunidades 1,2. A pandemia de COVID-19, desdobrou a importância de melhorar os métodos de concentração. A COVID-19 surgiu no final de 2019 e, em março de 2023, ainda representa uma ameaça à saúde humana, à vida social e à economia. Estratégias eficazes de vigilância e controle para aliviar os impactos dos surtos de COVID-19 nas comunidades tornaram-se um importante tópico de pesquisa, à medida que novas ondas e variantes da COVID-19 têm surgido, além da rápida transmissão e disseminação do vírus, bem como casos assintomáticos não notificados e não diagnosticados 3,4,5. O uso da epidemiologia baseada em águas residuais para COVID-19 por organizações da sociedade civil, agências governamentais e serviços públicos ou privados tem sido útil para fornecer informações rápidas relacionadas a surtos e mitigar os impactos de surtos de COVID-19 6,7,8,9. No entanto, a concentração de SARS-CoV-2, um vírus de RNA envelopado, em amostras de águas residuais ainda apresenta desafios10. Por exemplo, um desses desafios é a partição do SARS-CoV-2 em sólidos de águas residuais, o que pode impactar a recuperação quando os sólidos são eliminados durante a concentração11. Se este for o caso, o foco da quantificação/avaliação deve ser nas fases sólida e aquosa das amostras de água ambiental, e não apenas na fase aquosa. Além disso, a escolha do método de concentração pode ser modificada com base em ensaios e análises a jusante. A concentração de partículas virais e patógenos a partir de amostras ambientais tornou-se um tópico de pesquisa urgente com desenvolvimentos nos campos de sequenciamento e microbioma.
Vários métodos de concentração de vírus têm sido aplicados no campo da concentração de vírus a partir de amostras ambientais de água e efluentes. Alguns métodos comumente utilizados são filtração, floculação de leite desnatado (FMS), adsorção/eluição e precipitação de polietilenoglicol12-17. Dentre eles, o SMF tem sido considerado um método barato e eficaz, testado com sucesso e aplicado na recuperação de vírus, incluindo o SARS-CoV-2, de águas residuárias e superficiais12,15,16,18. O procedimento SMF é uma abordagem relativamente nova que tem ganhado crescente reconhecimento entre muitos estudos ambientais como uma metodologia apropriada para recuperar simultaneamente uma ampla gama de microrganismos, como vírus, bactérias e protozoários, de todos os tipos de amostras de água, a saber, lodo, esgoto bruto, efluentes e amostras de efluentes19. Quando comparada a outras metodologias conhecidas para recuperar vírus de amostras ambientais, como ultrafiltração e eluição glicina-alcalina, abordagem baseada em liofilização ou ultracentrifugação e eluição glicina-alcalina, a FMM tem sido relatada como o método mais eficiente, com maiores taxas de recuperação e detecção viral18,20. No presente estudo, usamos o RNA blindado como um vírus de teste para avaliar a eficiência da recuperação dos métodos de concentração do vírus, incluindo testes para avaliar a recuperação do SARS-CoV-221,22.
Aqui, testamos amostras de águas residuais e ambientais para demonstrar a utilidade da SMF e de um método de ultrafiltração sequencial para concentrar frações microbianas para reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), metagenômica baseada em sequência e sequenciamento de amplicon profundo. O SMF é um método relativamente mais barato e ideal para um volume maior de amostras em comparação com os métodos de ultrafiltração. A ideia de usar um método de ultrafiltração sequencial surgiu da necessidade de diminuir o volume final dos concentrados virais durante a pandemia de COVID-19, quando o fornecimento dos dispositivos de ultrafiltração comumente usados era limitado, e havia a necessidade do desenvolvimento de métodos alternativos de concentração viral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma das etapas críticas neste estudo é a eliminação de partículas sólidas através da aplicação de uma etapa de pré-filtração com filtros de membrana de 0,2 μm e 0,45 μm. Considerando a partição de vírus em partículas sólidas, especialmente vírus envelopados, a pré-filtração pode causar uma perda significativa na recuperação viral30. Embora uma etapa de pré-filtragem para métodos de ultrafiltração seja quase sempre necessária para amostras ambientais e de águas residu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela NSERC Alliance Covid-19 Grant (Prêmio No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan e Uyaguari-Díaz). A MUD agradece ao Programa de Bolsas de Pesquisa da Universidade (Prêmio nº 325201). Tanto a JF quanto a JZA são apoiadas pelo programa de treinamento de pós-graduação Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY e JF receberam bolsas do programa Mitacs Acelerar. MUD e seus membros do laboratório (KY, JF, JZA) são apoiados pelo NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) e pela bolsa Research Manitoba New Investigator Operating (nº 5385). Agradecimentos especiais à cidade de Winnipeg, Manitoba. Esta pesquisa foi conduzida na Universidade de Manitoba. Gostaríamos de reconhecer que os campi da Universidade de Manitoba estão localizados nas terras originais dos povos Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota e Dene e na terra natal da Nação Métis.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
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