Concentrazione di particelle virali da campioni di acqua ambientale e acque reflue mediante flocculazione e ultrafiltrazione del latte scremato
Summary
La concentrazione di virus da campioni di acqua ambientale e acque reflue è un compito impegnativo, svolto principalmente per l’identificazione e la quantificazione dei virus. Mentre diversi metodi di concentrazione del virus sono stati sviluppati e testati, dimostriamo qui l’efficacia dell’ultrafiltrazione e della flocculazione del latte scremato per i virus a RNA con diversi tipi di campioni.
Abstract
L’epidemiologia basata sull’acqua e sulle acque reflue è emersa come metodi alternativi per monitorare e prevedere il corso delle epidemie nelle comunità. Il recupero di frazioni microbiche, inclusi virus, batteri e microeucarioti dalle acque reflue e dai campioni di acqua ambientale è uno dei passaggi impegnativi in questi approcci. In questo studio, ci siamo concentrati sull’efficienza di recupero dell’ultrafiltrazione sequenziale e dei metodi di flocculazione del latte scremato (SMF) utilizzando l’RNA corazzato come virus di prova, che viene anche utilizzato come controllo da alcuni altri studi. La prefiltrazione con filtri a disco a membrana da 0,45 μm e 0,2 μm è stata applicata per eliminare le particelle solide prima dell’ultrafiltrazione per prevenire l’intasamento dei dispositivi di ultrafiltrazione. I campioni di prova, elaborati con il metodo dell’ultrafiltrazione sequenziale, sono stati centrifugati a due diverse velocità. Una maggiore velocità ha comportato minori tassi di recupero e positività dell’RNA corazzato. D’altra parte, SMF ha portato a tassi di recupero e positività relativamente coerenti di RNA corazzato. Ulteriori test condotti con campioni di acqua ambientale hanno dimostrato l’utilità di SMF per concentrare altre frazioni microbiche. Il partizionamento dei virus in particelle solide potrebbe avere un impatto sui tassi di recupero complessivi, considerando la fase di prefiltrazione applicata prima dell’ultrafiltrazione dei campioni di acque reflue. SMF con prefiltrazione ha funzionato meglio quando applicato a campioni di acqua ambientale a causa di concentrazioni solide inferiori nei campioni e quindi tassi di ripartizione inferiori ai solidi. Nel presente studio, l’idea di utilizzare un metodo di ultrafiltrazione sequenziale è nata dalla necessità di ridurre il volume finale dei concentrati virali durante la pandemia di COVID-19, quando la fornitura dei dispositivi di ultrafiltrazione comunemente usati era limitata e vi era la necessità di sviluppare metodi alternativi di concentrazione virale.
Introduction
Determinare la concentrazione effettiva di microrganismi nei campioni di superficie e di acque reflue per l’analisi della comunità microbica e gli studi epidemiologici è uno dei passi importanti per monitorare e prevedere il decorso delle epidemie nelle comunità 1,2. La pandemia di COVID-19 ha rivelato l’importanza di migliorare i metodi di concentrazione. COVID-19 è emerso alla fine del 2019 e, a partire da marzo 2023, rappresenta ancora una minaccia per la salute umana, la vita sociale e l’economia. Strategie efficaci di sorveglianza e controllo per alleviare gli impatti delle epidemie di COVID-19 nelle comunità sono diventate un importante argomento di ricerca, poiché sono emerse nuove ondate e varianti di COVID-19 oltre alla rapida trasmissione e diffusione del virus, nonché casi asintomatici non segnalati e non diagnosticati 3,4,5. L’uso dell’epidemiologia basata sulle acque reflue per COVID-19 da parte di organizzazioni della società civile, agenzie governative e servizi pubblici o privati è stato utile per fornire rapidamente informazioni relative all’epidemia e mitigare gli impatti delle epidemie di COVID-19 6,7,8,9. Tuttavia, la concentrazione di SARS-CoV-2, un virus RNA avvolto, nei campioni di acque reflue pone ancora sfide10. Ad esempio, una di queste sfide è la ripartizione di SARS-CoV-2 nei solidi delle acque reflue, che può influire sul recupero quando i solidi vengono eliminati durante la concentrazione11. In tal caso, la quantificazione/valutazione dovrebbe concentrarsi sia sulla fase solida che su quella acquosa dei campioni di acqua ambientale, piuttosto che sulla sola fase acquosa. Inoltre, la scelta del metodo di concentrazione può essere modificata sulla base di prove e analisi a valle. La concentrazione di particelle virali e agenti patogeni da campioni ambientali è diventata un argomento di ricerca urgente con sviluppi nei campi del sequenziamento e del microbioma.
Vari metodi di concentrazione del virus sono stati applicati nel campo della concentrazione di virus da campioni di acque ambientali e acque reflue. Alcuni metodi comunemente usati sono la filtrazione, la flocculazione del latte scremato (SMF), l’adsorbimento / eluizione e la precipitazione del glicole polietilenico12-17. Tra questi, SMF è stato considerato un metodo economico ed efficace, testato con successo e applicato per il recupero di virus, tra cui SARS-CoV-2, dalle acque reflue e superficiali12,15,16,18. La procedura SMF è un approccio relativamente nuovo che ha ottenuto un maggiore riconoscimento tra molti studi ambientali come metodologia appropriata per recuperare simultaneamente una vasta gamma di microrganismi come virus, batteri e protozoi da tutti i tipi di campioni di acqua, vale a dire fanghi, acque reflue grezze, acque reflue e campioni di effluenti19. Rispetto ad altre metodologie note per recuperare virus da campioni ambientali come l’ultrafiltrazione e l’eluizione glicina-alcalina, l’approccio basato sulla liofilizzazione o l’ultracentrifugazione e l’eluizione glicina-alcalina, SMF è stato segnalato come il metodo più efficiente con tassi di recupero e rilevamento virali più elevati18,20. Nel presente studio, abbiamo utilizzato l’RNA corazzato come virus di prova per valutare l’efficienza di recupero dei metodi di concentrazione del virus, compresi i test per valutare il recupero di SARS-CoV-221,22.
Qui, abbiamo testato campioni di acque reflue e acque ambientali per dimostrare l’utilità di SMF e un metodo di ultrafiltrazione sequenziale per concentrare le frazioni microbiche per la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), la metagenomica basata sulla sequenza e il sequenziamento dell’amplicone profondo. SMF è un metodo relativamente più economico e ottimale per un volume maggiore di campioni rispetto ai metodi di ultrafiltrazione. L’idea di utilizzare un metodo di ultrafiltrazione sequenziale è nata dalla necessità di ridurre il volume finale dei concentrati virali durante la pandemia di COVID-19, quando la fornitura dei dispositivi di ultrafiltrazione comunemente usati era limitata e c’era la necessità di sviluppare metodi alternativi di concentrazione virale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno dei passaggi critici in questo studio è l’eliminazione delle particelle solide applicando una fase di prefiltrazione con filtri a membrana da 0,2 μm e 0,45 μm. Considerando il partizionamento dei virus in particelle solide, in particolare i virus avvolti, la prefiltrazione può causare una perdita significativa nel recupero virale30. Mentre una fase di prefiltrazione per i metodi di ultrafiltrazione è quasi sempre necessaria per i campioni ambientali e di acque reflue per prevenire l’intas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NSERC Alliance Covid-19 Grant (Premio n. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan e Uyaguari-Díaz). MUD desidera ringraziare il programma di borse di ricerca universitarie (premio n. 325201). Sia JF che JZA sono supportati dal programma di formazione per laureati Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY e JF hanno entrambi ricevuto borse di studio dal programma Mitacs Accelerate. MUD e i suoi membri del laboratorio (KY, JF, JZA) sono supportati da NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) e dalla sovvenzione Research Manitoba New Investigator Operating (No 5385). Un ringraziamento speciale alla città di Winnipeg, Manitoba. Questa ricerca è stata condotta presso l’Università di Manitoba. Vorremmo riconoscere che i campus dell’Università di Manitoba si trovano sulle terre originali dei popoli Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota e Dene e sulla patria della nazione Métis.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
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