Yağsız Süt Flokülasyonu ve Ultrafiltrasyon Kullanılarak Çevresel Su ve Atık Su Numunelerinden Virüs Partiküllerinin Konsantrasyonu
Summary
Çevresel su ve atık su örneklerinden virüs konsantrasyonu, öncelikle virüslerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için gerçekleştirilen zorlu bir görevdir. Çeşitli virüs konsantrasyon yöntemleri geliştirilmiş ve test edilmiş olsa da, burada farklı numune tiplerine sahip RNA virüsleri için ultrafiltrasyon ve yağsız süt topaklaşmasının etkinliğini gösteriyoruz.
Abstract
Su ve atık su bazlı epidemiyoloji, topluluklardaki salgınların seyrini izlemek ve tahmin etmek için alternatif yöntemler olarak ortaya çıkmıştır. Atık su ve çevresel su örneklerinden virüsler, bakteriler ve mikroökaryotlar dahil olmak üzere mikrobiyal fraksiyonların geri kazanımı, bu yaklaşımlardaki zorlu adımlardan biridir. Bu çalışmada, diğer bazı çalışmalarda da kontrol olarak kullanılan Armored RNA’yı test virüsü olarak kullanan sıralı ultrafiltrasyon ve yağsız süt topaklaştırma (SMF) yöntemlerinin geri kazanım etkinliğine odaklandık. Ultrafiltrasyon cihazlarının tıkanmasını önlemek için ultrafiltrasyondan önce katı partikülleri ortadan kaldırmak için 0,45 μm ve 0,2 μm membran disk filtreleri ile ön filtreleme uygulanmıştır. Sıralı ultrafiltrasyon yöntemi ile işlenen test numuneleri iki farklı hızda santrifüj edildi. Artan hız, Zırhlı RNA’nın daha düşük iyileşme ve pozitiflik oranlarına neden oldu. Öte yandan, SMF, Zırhlı RNA’nın nispeten tutarlı iyileşme ve pozitiflik oranları ile sonuçlandı. Çevresel su örnekleri ile yapılan ek testler, SMF’nin diğer mikrobiyal fraksiyonları konsantre etmek için faydasını göstermiştir. Virüslerin katı parçacıklara bölünmesi, atık su numunelerinin ultrafiltrasyonundan önce uygulanan ön filtreleme adımı göz önüne alındığında, genel geri kazanım oranları üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Ön filtrelemeli SMF, numunelerdeki daha düşük katı konsantrasyonları ve dolayısıyla katılara daha düşük bölümleme oranları nedeniyle çevresel su numunelerine uygulandığında daha iyi performans göstermiştir. Bu çalışmada, sıralı bir ultrafiltrasyon yönteminin kullanılması fikri, yaygın olarak kullanılan ultrafiltrasyon cihazlarının tedarikinin sınırlı olduğu ve alternatif viral konsantrasyon yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulduğu COVID-19 pandemisi sırasında viral konsantrelerin nihai hacminin azaltılması gerekliliğinden doğmuştur.
Introduction
Mikrobiyal topluluk analizi ve epidemiyoloji çalışmaları için yüzey ve atık su numunelerinde mikroorganizmaların etkin konsantrasyonunun belirlenmesi, topluluklardaki salgınların seyrinin izlenmesi ve tahmin edilmesi için önemli adımlardan biridir 1,2. COVID-19 pandemisi, konsantrasyon yöntemlerinin iyileştirilmesinin önemini ortaya koydu. COVID-19, 2019’un sonlarında ortaya çıktı ve Mart 2023 itibariyle hala insan sağlığı, sosyal yaşam ve ekonomi için bir tehdit oluşturuyor. COVID-19 salgınlarının toplumlardaki etkilerini hafifletmek için etkili sürveyans ve kontrol stratejileri, virüsün hızlı bulaşması ve yayılmasının yanı sıra bildirilmemiş ve teşhis edilmemiş asemptomatik vakaların yanı sıra COVID-19’un yeni dalgaları ve varyantları ortaya çıktığı için önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir 3,4,5. Sivil toplum kuruluşları, devlet kurumları ve kamu veya özel kuruluşlar tarafından COVID-19 için atık su bazlı epidemiyolojinin kullanılması, salgınla ilgili hızlı bilgi sağlamada ve COVID-19 salgınlarının etkilerini azaltmada yardımcı olmuştur 6,7,8,9. Bununla birlikte, zarflı bir RNA virüsü olan SARS-CoV-2’nin atık su numunelerindeki konsantrasyonu hala zorluklar yaratmaktadır10. Örneğin, bu zorluklardan biri, SARS-CoV-2’nin atık su katılarında bölünmesidir ve bu da konsantrasyon11 sırasında katılar elimine edildiğinde geri kazanımı etkileyebilir. Bu durumda, niceleme/değerlendirmenin odak noktası, yalnızca sulu faz yerine, çevresel su numunelerinin hem katı hem de sulu fazları üzerinde olmalıdır. Ayrıca, konsantrasyon yönteminin seçimi, çıkış yönündeki testlere ve analizlere dayanarak değiştirilebilir. Çevresel örneklerden virüs partiküllerinin ve patojenlerin konsantrasyonu, dizileme ve mikrobiyom alanlarındaki gelişmelerle birlikte acil bir araştırma konusu haline gelmiştir.
Çevresel su ve atık su örneklerinden virüs konsantrasyonu alanında çeşitli virüs konsantrasyon yöntemleri uygulanmıştır. Yaygın olarak kullanılan bazı yöntemler filtrasyon, yağsız süt flokülasyonu (SMF), adsorpsiyon / elüsyon ve polietilen glikol çökeltme12-17’dir. Bunlar arasında SMF, ucuz ve etkili bir yöntem olarak kabul edilmiş, başarıyla test edilmiş ve SARS-CoV-2 de dahil olmak üzere virüslerin atık sulardan ve yüzey sularından geri kazanılması için uygulanmıştır12,15,16,18. SMF prosedürü, birçok çevresel çalışma arasında, virüsler, bakteriler ve protozoonlar gibi geniş bir mikroorganizma dizisini her türlü su numunesinden, yani çamur, ham kanalizasyon, atık su ve atık su numunelerinden aynı anda geri kazanmak için uygun bir metodoloji olarak artan bir tanıma sahip olan nispeten yeni bir yaklaşımdır19. Ultrafiltrasyon ve glisin-alkali elüsyonu, liyofilizasyona dayalı yaklaşım veya ultrasantrifüjleme ve glisin-alkali elüsyonu gibi çevresel örneklerden virüsleri kurtarmak için bilinen diğer metodolojilerle karşılaştırıldığında, SMF’nin daha yüksek viral geri kazanım ve tespit oranlarına sahip en etkili yöntem olduğu bildirilmiştir 18,20. Bu çalışmada, SARS-CoV-2 geri kazanımını değerlendirmek için testler de dahil olmak üzere virüs konsantrasyon yöntemlerinin geri kazanım verimliliğini değerlendirmek için Zırhlı RNA’yı bir test virüsü olarak kullandık21,22.
Burada, SMF’nin faydasını göstermek için atık su ve çevresel su örneklerini ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), sekans tabanlı metagenomik ve derin amplikon dizilemesi için mikrobiyal fraksiyonları konsantre etmek için sıralı bir ultrafiltrasyon yöntemini test ettik. SMF nispeten daha ucuz bir yöntemdir ve ultrafiltrasyon yöntemlerine kıyasla daha büyük miktarda numune için idealdir. Sıralı bir ultrafiltrasyon yöntemi kullanma fikri, yaygın olarak kullanılan ultrafiltrasyon cihazlarının tedarikinin sınırlı olduğu ve alternatif viral konsantrasyon yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulduğu COVID-19 pandemisi sırasında viral konsantrelerin nihai hacminin azaltılması gerekliliğinden doğmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmadaki kritik adımlardan biri, 0,2 μm ve 0,45 μm membran filtrelerle bir ön filtreleme adımı uygulanarak katı partiküllerin elimine edilmesidir. Virüslerin katı parçacıklara, özellikle de zarflı virüslere bölünmesi göz önüne alındığında, ön filtrasyon viral iyileşmede önemli bir kayba neden olabilir30. Ultrafiltrasyon cihazlarının tıkanmasını önlemek için çevresel ve atık su numuneleri için ultrafiltrasyon yöntemleri için bir ön filtreleme adımı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NSERC Alliance Covid-19 Grant (Ödül No. 431401363, 2020-2021, Dr. Yuan ve Uyaguari-Díaz) tarafından desteklenmiştir. MUD, Üniversite Araştırma Hibeleri Programına (Ödül No. 325201) teşekkür eder. Hem JF hem de JZA, Görsel ve Otomatik Hastalık Analitiği (VADA) lisansüstü eğitim programı tarafından desteklenmektedir. KY ve JF, Mitacs Accelerate programından burs aldı. MUD ve laboratuvar üyeleri (KY, JF, JZA), NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) ve Research Manitoba New Investigator Operating grant (No 5385) tarafından desteklenmektedir. Winnipeg, Manitoba Şehri’ne özel teşekkürler. Bu araştırma Manitoba Üniversitesi’nde yapılmıştır. Manitoba Üniversitesi kampüslerinin Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota ve Dene halklarının orijinal topraklarında ve Métis Ulusunun anavatanında bulunduğunu kabul etmek isteriz.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
References
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
- Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
- Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
- Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
- Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
- Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
- Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
- Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
- Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
- Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
- Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
- Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
- Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
- Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
- Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
- Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
- Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
- Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
- Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
- Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
- Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
- Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
- Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
- . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
- Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
- Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
- Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
- Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).
