Concentration de particules virales provenant d’échantillons d’eau et d’eaux usées prélevés dans l’environnement par floculation et ultrafiltration du lait écrémé
Summary
La concentration de virus à partir d’échantillons d’eau et d’eaux usées dans l’environnement est une tâche difficile, effectuée principalement pour l’identification et la quantification des virus. Bien que plusieurs méthodes de concentration virale aient été développées et testées, nous démontrons ici l’efficacité de l’ultrafiltration et de la floculation du lait écrémé pour les virus à ARN avec différents types d’échantillons.
Abstract
L’épidémiologie basée sur l’eau et les eaux usées est apparue comme des méthodes alternatives pour surveiller et prédire l’évolution des épidémies dans les communautés. La récupération des fractions microbiennes, y compris les virus, les bactéries et les microeucaryotes à partir d’échantillons d’eaux usées et d’eau environnementale est l’une des étapes difficiles de ces approches. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’efficacité de récupération de l’ultrafiltration séquentielle et des méthodes de floculation de lait écrémé (SMF) utilisant l’ARN blindé comme virus test, qui est également utilisé comme contrôle par d’autres études. Une préfiltration avec des filtres à disque à membrane de 0,45 μm et 0,2 μm a été appliquée pour éliminer les particules solides avant l’ultrafiltration afin d’éviter le colmatage des dispositifs d’ultrafiltration. Les échantillons d’essai, traités avec la méthode d’ultrafiltration séquentielle, ont été centrifugés à deux vitesses différentes. Une vitesse accrue a entraîné une baisse des taux de récupération et de positivité de l’ARN blindé. D’autre part, SMF a entraîné des taux de récupération et de positivité relativement constants de l’ARN blindé. Des tests supplémentaires effectués avec des échantillons d’eau environnementale ont démontré l’utilité de SMF pour concentrer d’autres fractions microbiennes. La répartition des virus en particules solides pourrait avoir un impact sur les taux de récupération globaux, compte tenu de l’étape de préfiltration appliquée avant l’ultrafiltration des échantillons d’eaux usées. SMF avec préfiltration a donné de meilleurs résultats lorsqu’il est appliqué à des échantillons d’eau environnementale en raison de concentrations solides plus faibles dans les échantillons et donc de taux de séparation plus faibles dans les solides. Dans la présente étude, l’idée d’utiliser une méthode d’ultrafiltration séquentielle est née de la nécessité de diminuer le volume final des concentrés viraux pendant la pandémie de COVID-19, lorsque l’approvisionnement en dispositifs d’ultrafiltration couramment utilisés était limité et qu’il était nécessaire de développer d’autres méthodes de concentration virale.
Introduction
La détermination de la concentration effective de microorganismes dans les échantillons de surface et d’eaux usées pour l’analyse des communautés microbiennes et les études épidémiologiques est l’une des étapes importantes pour surveiller et prévoir l’évolution des éclosions dans les communautés 1,2. La pandémie de COVID-19 a révélé l’importance d’améliorer les méthodes de concentration. La COVID-19 est apparue à la fin de 2019 et, en mars 2023, constitue toujours une menace pour la santé humaine, la vie sociale et l’économie. Les stratégies efficaces de surveillance et de contrôle visant à atténuer les répercussions des éclosions de COVID-19 dans les communautés sont devenues un sujet de recherche important, car de nouvelles vagues et variantes de la COVID-19 ont fait leur apparition en plus de la transmission et de la propagation rapides du virus, ainsi que des cas asymptomatiques non déclarés et non diagnostiqués 3,4,5. L’utilisation de l’épidémiologie basée sur les eaux usées pour la COVID-19 par les organisations de la société civile, les agences gouvernementales et les services publics ou privés a été utile pour fournir rapidement des informations liées à l’épidémie et atténuer les impacts des épidémies de COVID-19 6,7,8,9. Cependant, la concentration de SARS-CoV-2, un virus à ARN enveloppé, dans les échantillons d’eaux usées pose toujours des défis10. Par exemple, l’un de ces défis est la répartition du SRAS-CoV-2 dans les solides d’eaux usées, ce qui peut avoir une incidence sur la récupération lorsque les solides sont éliminés pendant la concentration11. Si tel est le cas, la quantification/évaluation devrait être axée sur les phases solide et aqueuse des échantillons d’eau environnementale, plutôt que sur la phase aqueuse seulement. En outre, le choix de la méthode de concentration peut être modifié en fonction des essais et des analyses en aval. La concentration de particules virales et d’agents pathogènes provenant d’échantillons environnementaux est devenue un sujet de recherche urgent avec les développements dans les domaines du séquençage et du microbiome.
Diverses méthodes de concentration virale ont été appliquées dans le domaine de la concentration virale à partir d’échantillons d’eau et d’eaux usées environnementales. Certaines méthodes couramment utilisées sont la filtration, la floculation de lait écrémé (SMF), l’adsorption/élution et la précipitation du polyéthylèneglycol12-17. Parmi eux, le SMF a été considéré comme une méthode peu coûteuse et efficace, testée avec succès et appliquée pour récupérer des virus, y compris le SARS-CoV-2, des eaux usées et des eaux de surface12,15,16,18. La procédure SMF est une approche relativement nouvelle qui est de plus en plus reconnue par de nombreuses études environnementales comme une méthodologie appropriée pour récupérer simultanément un large éventail de micro-organismes tels que des virus, des bactéries et des protozoaires à partir de tous les types d’échantillons d’eau, à savoir les échantillons de boues, d’eaux usées brutes, d’eaux usées et d’effluents19. Comparativement à d’autres méthodes connues de récupération de virus à partir d’échantillons environnementaux, comme l’ultrafiltration et l’élution glycine-alcaline, l’approche basée sur la lyophilisation ou l’ultracentrifugation et l’élution glycine-alcaline, la FMS a été signalée comme la méthode la plus efficace avec des taux de récupération et de détection virale plus élevés18,20. Dans la présente étude, nous avons utilisé l’ARN blindé comme virus test pour évaluer l’efficacité de récupération des méthodes de concentration virale, y compris les tests pour évaluer la récupération du SARS-CoV-221,22.
Ici, nous avons testé des échantillons d’eaux usées et d’eau environnementale pour démontrer l’utilité de la SMF et d’une méthode d’ultrafiltration séquentielle pour concentrer les fractions microbiennes pour la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR), la métagénomique basée sur les séquences et le séquençage à amplicon profond. La SMF est une méthode relativement moins chère et optimale pour un plus grand volume d’échantillons par rapport aux méthodes d’ultrafiltration. L’idée d’utiliser une méthode d’ultrafiltration séquentielle est née de la nécessité de diminuer le volume final des concentrés viraux pendant la pandémie de COVID-19, lorsque l’approvisionnement en dispositifs d’ultrafiltration couramment utilisés était limité et qu’il était nécessaire de développer d’autres méthodes de concentration virale.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’une des étapes critiques de cette étude est l’élimination des particules solides par l’application d’une étape de préfiltration avec des filtres à membrane de 0,2 μm et 0,45 μm. Compte tenu de la répartition des virus en particules solides, en particulier en virus enveloppés, la préfiltration peut entraîner une perte importante de récupérationvirale30. Alors qu’une étape de préfiltration pour les méthodes d’ultrafiltration est presque toujours nécessaire pour les é…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la subvention Covid-19 de l’Alliance du CRSNG (bourse no 431401363, 2020-2021, Drs Yuan et Uyaguari-Díaz). MUD tient à remercier le Programme de subventions de recherche universitaire (prix no 325201). JF et JZA sont tous deux soutenus par le programme de formation des diplômés Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY et JF ont tous deux reçu des bourses du programme Mitacs Accélération. MUD et ses membres de laboratoire (KY, JF, JZA) sont soutenus par le GENSNG-DG (RGPIN-2022-04508) et la subvention de fonctionnement pour nouveaux chercheurs de Research Manitoba (no 5385). Un merci spécial à la Ville de Winnipeg, au Manitoba. Cette recherche a été menée à l’Université du Manitoba. Nous tenons à souligner que les campus de l’Université du Manitoba sont situés sur les terres originales des peuples Anishinaabeg, Cri, Oji-Cri, Dakota et Déné et sur la patrie de la Nation métisse.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
References
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
- Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
- Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
- Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
- Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
- Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
- Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
- Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
- Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
- Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
- Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
- Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
- Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
- Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
- Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
- Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
- Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
- Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
- Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
- Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
- Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
- Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
- Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
- . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
- Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
- Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
- Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
- Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).
