ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון
Summary
ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים הוא משימה מאתגרת, המתבצעת בעיקר לזיהוי וכימות נגיפים. בעוד מספר שיטות ריכוז וירוסים פותחו ונבדקו, אנו מדגימים כאן את היעילות של ultrafiltration ו flocculation חלב דל שומן עבור וירוסים RNA עם סוגי דגימה שונים.
Abstract
אפידמיולוגיה מבוססת מים ושפכים התפתחה כשיטות חלופיות לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות. ההתאוששות של שברים מיקרוביאליים, כולל וירוסים, חיידקים ומיקרו-איקריוטים מדגימות שפכים ומים סביבתיים היא אחד הצעדים המאתגרים בגישות אלה. במחקר זה, התמקדנו ביעילות ההתאוששות של שיטות אולטרה-סינון רציפות ופלוקולציית חלב דל שומן (SMF) באמצעות RNA משוריין כנגיף בדיקה, המשמש גם כבקרה על ידי כמה מחקרים אחרים. סינון מקדים עם מסנני דיסק ממברנות 0.45 מיקרומטר ו- 0.2 מיקרומטר יושמו כדי לחסל חלקיקים מוצקים לפני אולטרה-סינון כדי למנוע סתימה של מכשירי אולטרה-סינון. דגימות הבדיקה, שעובדו בשיטת אולטרה-סינון רציף, צוננו בשתי מהירויות שונות. מהירות מוגברת הביאה לשיעורי התאוששות וחיוביות נמוכים יותר של RNA משוריין. מצד שני, SMF הביא להתאוששות עקבית יחסית ושיעורי חיוביות של RNA משוריין. בדיקות נוספות שנערכו עם דגימות מים סביבתיות הדגימו את התועלת של SMF לריכוז שברים מיקרוביאליים אחרים. חלוקת הנגיפים לחלקיקים מוצקים עשויה להשפיע על שיעורי ההתאוששות הכוללים, בהתחשב בשלב הסינון המוקדם המיושם לפני אולטרה-סינון של דגימות שפכים. SMF עם קדם-סינון הפגין ביצועים טובים יותר כאשר יושם על דגימות מים סביבתיים עקב ריכוזים מוצקים נמוכים יותר בדגימות ולכן שיעורי חלוקה נמוכים יותר למוצקים. במחקר הנוכחי עלה הרעיון להשתמש בשיטת אולטרה-סינון רציפה מתוך הצורך להקטין את הנפח הסופי של תרכיזי הנגיפים בתקופת הקורונה, כאשר אספקת מכשירי האולטרה-סינון הנפוצים הייתה מוגבלת, והיה צורך בפיתוח שיטות חלופיות לריכוז הנגיף.
Introduction
קביעת הריכוז האפקטיבי של מיקרואורגניזמים בדגימות פני השטח והשפכים לצורך ניתוח קהילות מיקרוביאליות ומחקרים אפידמיולוגיים, היא אחד הצעדים החשובים לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות 1,2. מגפת הקורונה, גילתה את החשיבות של שיפור שיטות הריכוז. נגיף הקורונה פרץ בסוף 2019 ונכון למרץ 2023 עדיין מהווה איום על בריאות האדם, חיי החברה והכלכלה. אסטרטגיות מעקב ובקרה יעילות להקלת ההשפעות של התפרצויות COVID-19 בקהילות הפכו לנושא מחקר חשוב, שכן גלים ווריאנטים חדשים של COVID-19 צצים בנוסף להעברה והתפשטות המהירה של הנגיף, כמו גם מקרים אסימפטומטיים לא מדווחים ולא מאובחנים 3,4,5. השימוש באפידמיולוגיה מבוססת שפכים עבור COVID-19 על ידי ארגוני חברה אזרחית, סוכנויות ממשלתיות ושירותים ציבוריים או פרטיים סייע לספק מידע מהיר הקשור להתפרצות ולמתן את ההשפעות של התפרצויות COVID-19 6,7,8,9. עם זאת, ריכוז SARS-CoV-2, נגיף RNA עטוף, בדגימות שפכים עדיין מציב אתגרים10. לדוגמה, אחד האתגרים האלה הוא חלוקה של SARS-CoV-2 במוצקי שפכים, אשר עשוי להשפיע על התאוששות כאשר מוצקים מסולקים במהלך ריכוז11. אם זה המקרה, מוקד הכימות/הערכה צריך להיות הן בפאזה מוצקה והן בפאזה מימית של דגימות מים סביבתיות, ולא בפאזה המימית בלבד. יתר על כן, ניתן לשנות את בחירת שיטת הריכוז בהתבסס על בדיקות וניתוחים במורד הזרם. ריכוז חלקיקי הנגיף והפתוגנים מדגימות סביבתיות הפך לנושא מחקר דחוף עם התפתחויות בתחומי הריצוף והמיקרוביום.
שיטות שונות לריכוז וירוסים יושמו בתחום ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים. כמה שיטות נפוצות הן סינון, חלב דל שומן flocculation (SMF), ספיחה / elution, ופוליאתילן גליקול משקעים12-17. ביניהם, SMF נחשב שיטה זולה ויעילה, נבדק בהצלחה ויישם עבור שחזור וירוסים, כולל SARS-CoV-2, משפכים ומים עיליים12,15,16,18. נוהל SMF הוא גישה חדשה יחסית שזכתה להכרה גוברת בקרב מחקרים סביבתיים רבים כמתודולוגיה מתאימה לשחזור בו זמנית של מגוון רחב של מיקרואורגניזמים כגון וירוסים, חיידקים ופרוטוזואנים מכל סוגי דגימות המים, כלומר דגימות בוצה, שפכים גולמיים, שפכים וקולחים19. בהשוואה למתודולוגיות ידועות אחרות לשחזור וירוסים מדגימות סביבתיות כגון אולטרה-סינון והדבקת גליצין-אלקליין, גישה מבוססת ליופיליזציה, או אולטרה-צנטריפוגה ופליטת גליצין-אלקליין, SMF דווח כשיטה היעילה ביותר עם שיעורי התאוששות וזיהוי נגיפיים גבוהים יותר18,20. במחקר הנוכחי, השתמשנו ב-RNA משוריין כנגיף בדיקה כדי להעריך את יעילות ההתאוששות של שיטות ריכוז הנגיף, כולל בדיקות להערכת התאוששות SARS-CoV-221,22.
כאן, בדקנו דגימות שפכים ומים סביבתיים כדי להדגים את התועלת של SMF ושיטת אולטרה-סינון רציפה לריכוז שברים מיקרוביאליים עבור תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR), מטגנומיקה מבוססת רצפים וריצוף אמפליקון עמוק. SMF היא שיטה זולה יחסית ואופטימלית לנפח גדול יותר של דגימות בהשוואה לשיטות אולטרה-סינון. הרעיון להשתמש בשיטת אולטרה-סינון רציפה נבע מהצורך להקטין את הנפח הסופי של תרכיזי הנגיפים בתקופת הקורונה, כאשר אספקת מכשירי האולטרה-סינון הנפוצים הייתה מוגבלת, והיה צורך בפיתוח שיטות חלופיות לריכוז הנגיף.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחד השלבים הקריטיים במחקר זה הוא חיסול חלקיקים מוצקים על ידי יישום שלב סינון מקדים עם מסנני קרום 0.2 מיקרומטר ו- 0.45 מיקרומטר. בהתחשב בחלוקה של וירוסים לחלקיקים מוצקים, במיוחד וירוסים עטופים, סינון מוקדם יכול לגרום לאובדן משמעותי בהתאוששות הנגיפים30. בעוד שלב טרום סינון עבור שיט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NSERC Alliance Covid-19 Grant (פרס מס ‘431401363, 2020-2021, ד”ר יואן ואויגווארי-דיאז). MUD רוצה להודות לתוכנית מענקי המחקר של האוניברסיטה (פרס מס ‘325201). הן JF והן JZA נתמכים על ידי תוכנית ההכשרה לתואר שני בניתוח מחלות חזותי ואוטומטי (VADA). KY ו-JF קיבלו שניהם מלגות מתוכנית Mitacs Accelerate. MUD וחברי המעבדה שלו (KY, JF, JZA) נתמכים על ידי NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) ומענק החוקר החדש של מחקר מניטובה (No 5385). תודה מיוחדת לעיר ויניפג, מניטובה. מחקר זה נערך באוניברסיטת מניטובה. ברצוננו להכיר בכך שהקמפוסים של אוניברסיטת מניטובה ממוקמים על האדמות המקוריות של עמי אנישינבג, קרי, אוג’י-קרי, דקוטה ודיין ועל מולדת אומת מטיס.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
References
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
- Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
- Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
- Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
- Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
- Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
- Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
- Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
- Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
- Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
- Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
- Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
- Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
- Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
- Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
- Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
- Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
- Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
- Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
- Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
- Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
- Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
- Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
- . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
- Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
- Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
- Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
- Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).
