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Neuroscience

Modelo Organoide Cerebral Humano de Transplante de Células Neurais

Published: July 21, 2023
doi:
10.3791/64770
, , ,
1Institut de Recherche en Immunologie et en Cancérologie,Université de Montréal, 2Terry Fox Laboratory,British Columbia Cancer Agency, 3Département de Pathologie et Biologie Cellulaire,Université de Montréal

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para o transplante e rastreamento de células neurais marcadas em organoides cerebrais humanos.

Abstract

O avanço das abordagens de transplante de células requer sistemas modelo que permitam uma avaliação precisa da potência funcional das células transplantadas. Para o sistema nervoso central, embora o xenotransplante permaneça no estado da arte, tais modelos são tecnicamente desafiadores, limitados em rendimento e caros. Além disso, os sinais ambientais presentes não reagem perfeitamente de forma cruzada com as células humanas. Este artigo apresenta um modelo barato, acessível e compatível com alto rendimento para o transplante e rastreamento de células neurais humanas em organoides cerebrais humanos. Esses organoides podem ser facilmente gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando kits comerciais e contêm os principais tipos de células do cérebro.

Primeiramente demonstramos esse protocolo de transplante com a injeção de células progenitoras neurais (NPCs) humanas marcadas com iPSC marcadas com EGFP nesses organoides. Em seguida, discutimos considerações para rastrear o crescimento dessas células no organoide por microscopia de fluorescência de células vivas e demonstramos o rastreamento de NPCs transplantadas marcadas com EGFP em um organoide durante um período de 4 meses. Finalmente, apresentamos um protocolo para seccionamento, coloração por imunofluorescência cíclica e imagem das células transplantadas em seu contexto local. O modelo de transplante organoide aqui apresentado permite o rastreamento em longo prazo (pelo menos 4 meses) de células humanas transplantadas diretamente em um microambiente humano com um protocolo barato e de simples execução. Representa, portanto, um modelo útil tanto para terapias de células neurais (transplantes) como, provavelmente, para modelar tumores do sistema nervoso central (SNC) de forma mais precisa do ponto de vista microambiental.

Introduction

O cérebro humano é um órgão complexo composto por múltiplos tipos celulares das linhagens neural e glial. Juntos, eles formam uma rede sofisticada que dá origem à cognição. Há um interesse significativo no transplante de células para esse sistema como tratamento para uma ampla variedade de distúrbios neurológicos, incluindo traumatismo cranioencefálico (TCE)1,2, doenças neurodegenerativas3,4,5,6,7 e acidente vascular cerebral8. Uma grande limitação no avanço de tais estratégias, no entanto, é a relativa escassez de modelos pré-clínicos disponíveis para determinar os resultados esperados do transplante. Os modelos mais utilizados atualmente são os métodos de cultivo in vitro para determinação do potencial celular e xenotransplante em camundongos. Embora os métodos de cultura celular possam avaliar a diferenciação e o potencial de auto-renovação9, estes são realizados sob condições ótimas de crescimento que não mimetizam o microambiente que as células encontrariam em um contexto de transplante. Além disso, a forma como as células são cultivadas pode influenciar seu comportamento10.

Cérebros de camundongos contêm todas as células do microambiente e são, portanto, sistemas modelo extremamente poderosos para transplante11. Há, no entanto, diferenças importantes entre o córtex de camundongo e humano12,13, e nem todos os fatores de crescimento reagem de forma cruzada entre as espécies. Modelos de primatas são uma alternativa mais próxima que mimetiza melhor o sistema humano e também têm produzido resultados pré-clínicos importantes14. Mesmo esses parentes mais próximos, no entanto, mantêm diferenças importantes em sua composição celular15. Embora ambos os sistemas-modelo forneçam informações valiosas sobre o comportamento celular durante o transplante e incorporem os elementos cirúrgicos de uma eventual terapia, eles permanecem imperfeitos. Eles também são caros e tecnicamente desafiadores (ou seja, deve-se realizar uma cirurgia cerebral nos animais), limitando assim o rendimento possível. Além disso, há uma infinidade de questões éticas associadas ao transplante de células cerebrais humanas em animais16. As culturas de fatias cerebrais permitem que um cérebro seja cortado e usado para múltiplos tratamentos, removendo assim algumas das limitações dos transplantes de animais; no entanto, estes têm vida útil limitada (semanas), ainda são derivados de animais e (sendo uma fatia fina) não têm volume/integridade de superfície suficiente para mimetizar a injeção de células17. Assim, permanece uma importante lacuna entre modelos estritamente de cultura celular/potencial e transplante in vivo.

Os organoides cerebrais são um modelo in vitro contendo os principais tipos de células neurais presentes no cérebro e podem ser gerados em grande número a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs)18,19. Tais organoides fornecem, assim, um contexto celular, que poderia permitir a avaliação da capacidade funcional de uma célula-teste de interesse no cenário do transplante. De fato, um estudo recente demonstrou que as células progenitoras neurais (NPCs) transplantadas em organoides cerebrais humanos sobrevivem, proliferam e se diferenciam de forma semelhante às NPCs transplantadas no cérebro de um camundongo com anemia imunodeficiente combinada (NSG)20. Os organoides cerebrais representam, portanto, um sistema livre de crueldade, de vida longa (>6 meses), econômico que captura os tipos celulares do cérebro humano. Como tal, eles poderiam representar um receptor de transplante ideal para o teste em estágio inicial da capacidade regenerativa das células neurais.

Este trabalho apresenta um protocolo para o transplante e posterior rastreamento de NPCs humanas marcadas em organoides cerebrais humanos (Figura 1). Isso começa com a injeção de NPCs marcados com GFP em organoides cerebrais maduros (2-4 meses de idade)18. As células transplantadas são seguidas por microscopia de fluorescência de células vivas durante um período de 4 meses. Durante esse tempo, mostramos tanto a persistência das células no local da injeção quanto a migração para regiões distais do organoide. Ao final, demonstramos a recuperação, coloração e imagem antigênica de cortes histológicos derivados desses organoides, incluindo um protocolo para a têmpera de corantes existentes à base de AlexaFluor para permitir rondas adicionais de coloração e imagem, com base em trabalhos anteriores21. Esse protocolo poderia, portanto, ser útil na mensuração da capacidade de diferenciação de células em um ambiente de transplante, durabilidade do enxerto, expansão celular in situ e migração celular do local do transplante. Prevemos que isso será útil tanto para aplicações de medicina regenerativa/terapia celular, bem como modelagem tumoral por enxertia de células tumorais em organoides específicos de região relevantes.

Protocol

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos utilizados neste protocolo. 1. Marcação de células fluoróforas por transdução lentiviral Descongelar uma alíquota da matriz de membrana basal solubilizada de escolha sobre gelo. Enquanto a alíquota estiver descongelando, adicione água estéril para preencher as lacunas entre os poços em uma placa de 24 poços, juntamente com todos os poços externos.NOTA: Isso deixa oito poços abertos no meio para uso e garante que as células permaneçam em alta umidade, minimizando assim a variabilidade induzida pela evaporação. Diluir a matriz da membrana basal solubilizada 1:100 em meio DMEM/F12 gelado (obteve-se concentração final de 0,089 mg/mL com o lote utilizado). Adicionar 300 μL da matriz diluída da membrana basal solubilizada a um dos poços médios (abertos) da placa preparada de 24 poços por infecção a ser realizada. Certifique-se de cobrir uniformemente todo o fundo do poço e adicione mais, se necessário, para garantir um revestimento uniforme. Incubar a placa durante 30 min a 37 °C para permitir que uma camada se solidifique ao longo do fundo do poço. Verifique no final desta incubação se o líquido ainda está cobrindo totalmente o fundo do poço e não evaporou no centro. A evaporação é um sinal de que a umidade está muito baixa; Se isso acontecer, repita o revestimento.NOTA: As placas podem ser revestidas na noite anterior e deixadas em matriz de membrana basal solubilizada diluída sem efeitos nocivos evidentes; No entanto, o risco de evaporação é muito maior, por isso devem ser cuidadosamente inspecionados antes do uso. Remova o meio de um poço de NPCs derivados de iPSC confluentes que crescem em uma placa de poço.NOTA: Para este trabalho, foram utilizados progenitores neurais derivados de iPSC produzidos usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante entre a passagem 3 e a passagem 10. Adicione suavemente 1 mL de PBS ao lado do poço e agite a placa para garantir uma lavagem uniforme. Retire o PBS e substitua por 300 μL da mistura de enzimas colagenolíticas e proteolíticas, balançando novamente a placa para garantir que o fundo do poço seja totalmente revestido. Incubar durante 5 min a 37 °C. Verifique se as células estão se desprendendo da superfície da placa por microscopia de luz. Com uma pipeta P1.000, adicione 700 μL de DMEM/F12 e desprenda as células pulverizando essa mistura em todas as superfícies do fundo da placa. Pipetar para cima e para baixo para garantir que os agregados celulares sejam divididos em uma suspensão uniforme de célula única. Pegue as células e adicione a 9 mL de meio DMEM/F12 em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 300 × g por 5 min. Durante esse tempo, preparar meio suficiente suplementado com 10 μM Y-27632 para 500 μL por poço a ser plaqueado, mais 1 mL para ressuspensão.NOTA: Y-27632 é necessário para garantir alta sobrevivência dos NPCs após a passagem como células únicas. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio suplementado com Y-27632, pipetando para cima e para baixo suavemente várias vezes para quebrar os agregados celulares. Retire alguns microlitros de células e dilua-as (1:5 a 1:10) em azul de tripano. Conte as células viáveis (tripano blue-negativo) em um hemocitômetro. Ajustar a diluição do azul de tripano para obter pelo menos 50 células viáveis por quadrante do hemocitômetro para garantir que as contagens sejam precisas. Calcule o volume de suspensão celular necessário para que 100.000 células estejam presentes em cada poço. Misture as células suavemente para cima e para baixo, pipetando, e ocupe o volume calculado (para 100.000 células por poço). Adicione isso ao meio suplementado com Y-27632 (a partir do passo 1.11) de modo que o volume final seja de 500 μL por poço a ser chapeado. Remova a matriz de membrana basal solubilizada diluída dos poços previamente revestidos (supondo que a incubação de 30 minutos ou mais tenha sido concluída). Misture as células suavemente por pipetagem e adicione 500 μL da suspensão celular a cada poço. Para distribuir uniformemente as células, mova a placa em um grande movimento de sinal “+” com varreduras lineares suaves (para frente-trás, parar, para trás-para trás) imediatamente antes de colocar em uma incubadora de cultura celular. Incubar durante a noite (16-24 h) a 37 °C e 5% CO2. Retire o meio e adicione o lentivírus titulado. Se eventos de integração únicos forem necessários, almeje uma multiplicidade de infecção de 0,3 unidades infecciosas por célula (idealmente tituladas nas células de interesse) e aumente até 500 μL em meio (sem Y-27632).NOTA: O lentivírus de interesse pode ser adquirido pré-titulado ou produzido internamente como feito anteriormente22. Aqui, um lentivírus GFP produzido internamente com resistência à puromicina foi usado para gerar e selecionar os NPCs que expressam EGFP. Se o lentivírus não tiver sido titulado nas células de interesse e o número de cópias for crítico, recomenda-se que vários volumes sejam adicionados a alguns poços e que o poço com ~30% de células EGFP+ 48-72 h seja usado mais tarde. Se o número de cópia não for crítico, o excesso de vírus pode ser adicionado com a ressalva de que a mutagênese insercional pode resultar em comportamento anômalo em alguns clones. CUIDADO: Os vetores lentivirais são um risco biológico de nível 2-3 (dependendo de seu conteúdo). Siga as normas locais de biossegurança para o manuseio do lentivírus, a descontaminação de superfícies e plásticos e resíduos líquidos. Devolver as células à incubadora e incubá-las durante 24 h a 37 °C e 5% de CO2. Remova as células da incubadora e remova o sobrenadante.ATENÇÃO: Como o sobrenadante das células ainda contém partículas lentivirais neste momento, continue seguindo as normas locais de biossegurança para seu manuseio e descarte. Enxaguar as células com 2 x 500 μL de PBS adicionando suavemente PBS à parede do poço; Em seguida, retire do canto do poço para lavar qualquer lentivírus restante.ATENÇÃO: Como o sobrenadante das células ainda contém partículas lentivirais neste momento, continue seguindo as normas locais de biossegurança para seu manuseio e descarte. Mude para 500 μL de meio fresco (sem Y-27632) e continue a crescer a 37 °C e 5% CO2 durante a noite. Use microscopia de fluorescência de células vivas para verificar a proporção de células que expressam EGFP e selecionar o poço com o qual prosseguir. Se o vetor lentiviral de escolha contiver um de seleção (gene de resistência a antibióticos, como resistência à puromicina), adicione o agente de seleção (aqui, 1 μg/mL de puromicina) ao meio em uma dose previamente validada que mata células sensíveis, mas não resistentes. Caso contrário, use a classificação de células ativadas por fluorescência para isolar as células EGFP+ no momento da primeira divisão. A partir de agora, mantenha as células com monitoramento diário para confluência e realize mudanças completas de meio diariamente. Quando a confluência for atingida, prepare um ou mais poços de uma placa fresca revestida de 6 poços (com 1 mL de matriz de membrana basal solubilizada diluída; ver etapas 1.3-1.5) e colha as células conforme descrito nas etapas 1.6-1.15.NOTA: Se nenhum agente de seleção for incluído, classifique as células por citometria de fluxo neste estágio. Certifique-se de que as células sejam classificadas com um bocal suficientemente largo e baixa pressão para minimizar o estresse, bem como que 10 μM Y-27632 sejam incluídos em cada etapa do processo de classificação. Plaquear as células até uma densidade final de 200.000 células/cm2. Mantenha o monitoramento diário e complete as trocas de meio diariamente.Observação : quando as células atingem novamente a confluência, elas agora estão prontas para uso. Alternativamente, um estoque agora pode ser congelado para uso futuro da seguinte maneira. Divida, colete e conte as células conforme descrito nas etapas 1.6-1.15. Pré-rotular um conjunto de criósculos com as informações relevantes (por exemplo, passagem, EGFP%, linha). Ressuspender a 400.000 células/mL em meio + DMSO 10%.NOTA: DMSO é tóxico para as células quando não congelado, por isso minimize o tempo gasto à temperatura ambiente na presença de DMSO. Adicionar 1 ml (400.000 células) da mistura do passo 1,33 por criovial e colocar num recipiente de congelação celular. Transfira o recipiente para um congelador de -80 °C durante a noite. No dia seguinte, transfira as células para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. 2. Injeção de células marcadas no organoide cerebral NOTA: Para este trabalho, organoides cerebrais foram produzidos usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante. Este pode ser substituído pelo organoide cerebral de interesse. Os materiais utilizados nesta parte do protocolo devem ser pré-resfriados para evitar a gelificação da matriz da membrana basal solubilizada a uma temperatura superior a 4 °C. Coloque a(s) seringa(s), ponta(s) e tubos de insulina que estarão em contato com a matriz da membrana basal solubilizada a -20 °C para deixá-los esfriar. Descongelar uma alíquota de tamanho adequado da matriz da membrana basal solubilizada no gelo, dependendo do número de injeções que serão realizadas (~2 μL/injeção). Isso leva aproximadamente 30 min. Enquanto a alíquota está descongelando, dividir, colher e contar as células conforme descrito nas etapas 1.6-1.15. Calcule os volumes necessários por injeção. Se fizer injeções múltiplas, coloque o volume total de células em um tubo de 1,5 mL e adicione até 1 mL de DMEM/F12.NOTA: Um volume que permita algumas injeções extras deve ser usado para contabilizar perdas/erros de pipetagem. Coloque as células no gelo enquanto os próximos passos estão sendo preparados. Após o descongelamento, diluir a matriz da membrana basal solubilizada até uma concentração final de 3 mg/mL em DMEM/F12 gelado. Retire a suspensão de célula única do gelo e gire-a a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.NOTA: Se uma centrífuga refrigerada não estiver disponível, a rotação à temperatura ambiente geralmente parece ser tolerada. Remova suavemente o meio completamente sem perturbar o pellet celular. Ressuspender o pellet de células por pipetagem suave na matriz de membrana basal solubilizada diluída (3 mg/mL) para obter um volume final de 2 μL por injeção a ser realizada e imediatamente colocá-lo novamente no gelo até o uso.OBS: A ressuspensão das células precisa ser realizada lentamente e com pontas pré-resfriadas para evitar a formação de bolhas e gelificação. Transfira a(s) seringa(s) pré-refrigerada(s) do congelador -20 °C para um balde de gelo. Mantenha-os lá até o uso. Remova a placa com os organoides cerebrais da incubadora. Use uma ponta de furo largo para transferir o organoide a ser injetado em uma placa de 35 mm. Retire todo o meio possível sem danificar o organoide para estabilizá-lo e facilitar a injeção.NOTA: É importante usar pontas de furo largo para evitar destruir o organoide. Se eles não estiverem disponíveis, corte a extremidade de uma ponta P1.000 regular com tesoura estéril. Coloque a placa de 35 mm contendo o organoide sob um microscópio dissecante para ajudar a orientar e facilitar a injeção.NOTA: Se um microscópio dissecante não estiver disponível em uma área estéril, é possível realizar a injeção sem um, embora com controle um pouco reduzido. Outra alternativa é o uso de um laço de ampliação ou óculos. Quando o(s) organoide(s) estiver(em) pronto(s) para ser injetado(s), ressuspenda suavemente as células com uma ponta de pipeta P20 resfriada e mova 2 μL (contendo o número desejado de células a serem injetadas) em uma lâmina de vidro estéril pré-resfriada.NOTA: Para injeções múltiplas, volumes adicionais de 2 μL podem ser adicionados em toda a lâmina de vidro. Mantenha-o no gelo e tome cuidado para evitar a evaporação. Tire uma seringa de insulina pré-refrigerada do gelo e retire lentamente os 2 μL de suspensão celular com o bisel da agulha virado para baixo para permitir que todas as células/meio sejam absorvidas.NOTA: Certifique-se de ir extremamente devagar para evitar desenhar em qualquer ar. Abra a tampa do prato que contém o organoide e concentre o microscópio nele. Segure o prato com uma mão. Coloque o bisel da agulha para cima e, com a outra mão, injete as células lentamente na superfície organoide.NOTA: É importante injetar lentamente para evitar danificar o tecido. Após a injeção, coloque a tampa de volta no prato e deixe o organoide injetado descansar por 1-2 min.NOTA: Isso permite que a matriz de membrana basal solubilizada diluída gelifique, mantendo as células no lugar. Se o meio for adicionado muito cedo, ele pode lavar as células que ficam na superfície. Adicione suavemente 500 μL do meio organoide e transfira o organoide com uma ponta de furo largo para um poço de uma placa de 24 poços. Incubar o organoide a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite. Realize trocas completas de meio a cada dois dias.OBS: É importante incluir um organoide de controle negativo (mock injected), que será utilizado para ajustes de imagem. Para isso, injetar um organoide como descrito anteriormente com matriz de membrana basal solubilizada diluída (3 mg/mL) para obter um volume final de 2 μL sem células. 3. Rastreamento do enxerto por imagem de fluorescência de células vivas NOTA: Use um microscópio de fluorescência que possa excitar o fluoróforo de interesse e tenha o conjunto de filtros necessário para detectar sua fluorescência. Como mencionado anteriormente, os NPCs usados aqui foram EGFP+, com um pico de excitação de 488 nm e um pico de emissão de ~510 nm. Carregue um organoide de controle negativo (não injetado ou simulado) e ajuste a intensidade da iluminação e o tempo de exposição de modo que a autofluorescência seja mínima. Para o instrumento utilizado, a intensidade de iluminação foi ajustada entre 1 e 2 e o tempo de exposição entre 80 ms e 100 ms.NOTA: Como muitos comprimentos de onda de excitação (particularmente comprimentos de onda mais baixos) podem ser tóxicos para as células, recomenda-se manter a intensidade baixa e evitar procurar por muito tempo para evitar danos ao organoide. Carregue o organoide de controle positivo e aumente o tempo de exposição, se necessário, para garantir que as células marcadas sejam claramente visíveis. Reposicione o organoide com uma ponta de pipeta de furo largo para encontrar o local de injeção (região EGFP+ ). Remova completamente o meio do organoide de controle negativo. Carregar o organoide de controle negativo e imaginá-lo com os ajustes selecionados (para o instrumento aqui utilizado, a intensidade de iluminação foi ajustada entre 1 e 2 e o tempo de exposição entre 80 ms e 100 ms). Quando a imagem estiver completa, adicione imediatamente meio fresco para evitar que o organoide seque.NOTA: A remoção do meio é fundamental para a obtenção de uma boa imagem, pois fixa a altura e a orientação dos organoides, que de outra forma estão flutuando e em constante movimento, impedindo imagens de alta qualidade. Repita a remoção/imagem do meio com cada um dos organoides de teste. Retorne os organoides à incubação/alterações normais do meio (como na etapa 2.16) e repita a imagem nos intervalos desejados. Aqui, os organoides foram fotografados na semana 1, semana 9 e semana 16 após a injeção para acompanhar e testar a sobrevivência, proliferação, diferenciação e migração dos NPCs EGFP+ injetados. 4. Histologia e imunofluorescência No ponto final, transfira o organoide para um histológico marcado com o ID do organoide e outros identificadores necessários. Encha o com 10% de formalina e feche-o. Manter em temperatura ambiente por 24 h. Transfira o fechado com o organoide para um processo tecidual e defina o seguinte protocolo: etanol 70% 10 min, etanol 80% 20 min, etanol 95% 30 min, etanol 100% 30 min, etanol 100% 40 min, etanol 100% 50 min, tolueno 30 min, tolueno 40 min, tolueno 50 min, parafina 25 min a 59 °C, parafina 35 min a 59 °C, parafina 40 min a 59 °C, parafina 50 min a 59 °C.NOTA: As etapas acima são feitas sob vácuo à temperatura ambiente, a menos que especificado de outra forma. Este protocolo substitui a água por gradientes de álcool de até 100%. A etapa intermediária com tolueno é uma transição entre o álcool e a parafina, pois ambos são solúveis nele. CUIDADO: Tolueno e parafina são considerados materiais perigosos, pois podem ser líquidos altamente inflamáveis e podem causar danos por inalação ou contato com a pele ou olhos. Certifique-se de armazená-los bem fechados em um espaço seguro. Use equipamentos de proteção individual adequados ao manuseá-los. Descarte os resíduos de acordo com as normas locais de risco químico. Transfira o fechado com o organoide para um banho de parafina na estação de incorporação. Retire o do banho, abra-o e transfira o organoide para um molde de base de aço. Coloque o molde sob o dispensador de parafina e cubra completamente com parafina. Coloque o vazio na parte superior do molde de base de aço. Aqui, adicione mais parafina por cima do. Transfira o molde de base de aço com o por cima para gelo e deixe esfriar por 5 min. Retire o molde de aço e mantenha o com o organoide embutido em um bloco de parafina. Transfira o para um micrótomo para cortar seções. Corte as seções conforme desejado.NOTA: Aqui, cortes de 15 μm de espessura foram feitos em todo o organoide. Coloque cada seção na superfície de um banho-maria regulado a 45 °C e recolha-a em uma lâmina de microscópio de vidro. Deixe as lâminas secarem em uma incubadora a 42 °C durante a noite.OBS: As lâminas agora podem ser armazenadas em temperatura ambiente até o momento da coloração. Coloque a lâmina em um frasco de coloração Coplin cheio de tolueno por 2 min. Repita esta etapa mais uma vez.CUIDADO: O tolueno é considerado um material perigoso, pois pode ser um líquido altamente inflamável e pode causar danos por inalação ou contato com a pele ou olhos. Certifique-se de guardá-lo bem fechado em um espaço seguro. Use equipamentos de proteção individual adequados ao manuseá-lo. Descarte os resíduos de acordo com as normas locais de risco químico. Transfira para um frasco de vidro Coplin preenchido com EtOH 100% por 2 min. Repita esta etapa mais uma vez. Transfira para um pote de coloração Coplin de vidro cheio de água destilada por 2 min. Repita esta etapa mais uma vez. Para recuperação de antígenos, preparar tampão citrato (ácido cítrico 10 mM, 0,05% Tween 20, pH 6,0).NOTA: O tampão citrato pode ser armazenado à temperatura ambiente por até 3 meses ou a 4 °C para armazenamento mais longo. Tome banho-maria entre 95 °C e 100 °C.CUIDADO: Este banho-maria pode causar queimaduras se não se tomar cuidado. Tome todas as precauções necessárias para evitar o contato direto com o banho ou seus componentes. No banho-maria, flutue um recipiente plástico que possa encaixar as lâminas dentro. Certifique-se de que o plástico não toque no fundo do banho (supondo que seja um banho de aquecimento do fundo) para evitar o derretimento. Despeje o tampão citrato dentro do recipiente plástico e deixe atingir 95-100 °C. Quando o tampão atingir a temperatura desejada, coloque as lâminas dentro do tampão e cubra o recipiente com uma tampa. Deixe as lâminas dentro do recipiente em banho-maria por 30-40 min. Retire o recipiente plástico do banho-maria e deixe esfriar em temperatura ambiente por mais 20 min. Lave as lâminas por 3 x 2 min com PBS. Remova o PBS com um lenço de papel sem tocar na amostra ou secá-la demais. Prepare o tampão de permeabilização (90 mL de PBS + 0,1% de Tween-20) e encha com ele um frasco de coloração de lâmina de vidro. Imergir as lâminas no tampão de permeabilização e incubar por 10 min. Lave as lâminas por 3 x 2 min com PBS. Prepare uma mistura de coloração suficiente para cobrir cada amostra (~25 μL).NOTA: Ver Tabela 1 para os anticorpos e as concentrações finais utilizadas aqui. Adicionar 25 μL de mistura de coloração para cobrir cada fatia de organoide. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h ou durante a noite a 4 °C no escuro.NOTA: Certifique-se de que as amostras permaneçam em alta umidade para evitar a evaporação da mistura de manchas. Se não houver um recipiente para manter as lâminas úmidas, coloque-as dentro de uma caixa com alguns lenços molhados no canto. Lave as lâminas por 3 x 2 min com PBS. Enxágue uma vez com água destilada dentro de um frasco de coloração de lâmina de vidro para remover o sal. Adicionar 10 μL de líquido montante + 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a cada uma das amostras.NOTA: As lâminas podem ser seladas se uma segunda rodada de coloração não for realizada. Aqui, as lâminas não foram cobertas para permitir o acesso para têmpera/retenção, pois a remoção do deslizamento pode danificar o tecido. Obtenha imagens das lâminas usando o microscópio de fluorescência selecionado.NOTA: Certifique-se de ter controles positivos e negativos para cada anticorpo para permitir o ajuste adequado das intensidades e tempos de exposição (para o instrumento usado aqui, a intensidade de iluminação foi definida entre 5 e 6 e o tempo de exposição entre 2.000 ms e 3.000 ms), embora isso possa variar dependendo do anticorpo. Além disso, certifique-se de que o microscópio tenha detectores adequados para cada canal utilizado. Esteja ciente de que, como as amostras não estão cobertas, elas precisam ser colocadas de bruços para cima durante a obtenção de imagens. Após a aquisição de imagens, prepare um tampão de têmpera fresco de 2x (9% H2O2 + 50 mM NaOH em PBS).NOTA: A solução de têmpera deve ser preparada imediatamente antes de a utilizar. A reação é sensível à atividade do H2O2, que diminuirá com o tempo. CUIDADO: H2O2 é irritante, e NaOH é cáustico. Estes devem ser tratados com equipamento de segurança adequado e o contacto com a pele deve ser evitado. Certifique-se de que eles sejam descartados de acordo com as políticas locais de segurança química. Encha o frasco de coloração de lâmina Coplin de vidro até a metade com 2x tampão de têmpera (45 mL), adicione 45 mL de PBS e coloque as lâminas dentro. Incubar durante a noite a 4 °C. Verificar por microscopia de fluorescência se os fluoróforos foram efetivamente extinguidos. Repita a coloração e a imagem como acima.NOTA: A têmpera e a retenção podem ser repetidas para rodadas adicionais, conforme necessário, embora o risco de danos aumente a cada rodada adicional. 5. Registro de imagens Abra FIJI. Faça uma pasta com as imagens DAPI da rodada 1 e da rodada 2. Altere os nomes para esclarecer qual é qual, se necessário. Crie uma pasta vazia para a saída do registro da imagem. Clique em Plugins | Inscrições | Registre fatias de pilha virtual. Em Diretório de origem, selecione a pasta que contém as imagens DAPI de cada rodada. Em Diretório de saída, selecione a pasta criada para a saída do registro. Defina o modelo de extração de recursos como Rígido e o menu suspenso Modelo de registro como Rígido – traduza+gire para corrigir o registro, permitindo apenas que a imagem seja movida e girada para alinhamento em vez de ser deformada.NOTA: Se a deformação for esperada, o modelo de extração de recursos e o modelo de registro podem ser ajustados para Affine ou outros modelos conforme desejado, embora isso possa resultar em transformações indesejadas. Ocasionalmente, uma fatia pode ser danificada entre as rodadas, o que pode impedir o registro bem-sucedido. Marque a caixa Salvar transformações para salvar os parâmetros de transformação, permitindo que eles sejam aplicados aos outros canais. Clique em OK. Selecione o local para salvar o arquivo de transformação (padrão para o diretório de entrada) e clique em Abrir. Selecione a imagem DAPI para servir de referência para as transformações. A imagem DAPI de cada uma das outras rodadas será alinhada a esta.Observação : quando concluído, as imagens registradas aparecerão como uma pilha (e na pasta de saída). Use a barra de slides na parte inferior para alternar entre as imagens para verificar se o registro da imagem foi bem-sucedido (os núcleos estão no mesmo lugar em ambas as imagens, pelo menos para as áreas sobrepostas). Verifique se um arquivo .xml foi criado para cada rodada das imagens de entrada.Observação : eles contêm os parâmetros de conversão necessários para os arquivos dessa rodada. Faça um folder contendo todas as imagens a serem cadastradas (cada canal de cada rodada). Observe a ordem dos arquivos. Crie uma pasta para os parâmetros de transformação e faça uma cópia do arquivo de .xml para cada rodada por canal a ser registrado. Verifique se a ordem dos arquivos (por nome) é a mesma entre as imagens a serem registradas e as cópias do parâmetro de transformação, pois a próxima etapa passará e transformará cada imagem na ordem dos arquivos de parâmetros de transformação. Clique em Plugins | Transformar | Transforme fatias de pilha virtual. Em Diretório de origem, selecione a pasta que contém as imagens a serem registradas. Em Diretório de saída, selecione a pasta criada para a saída do registro. Em Diretório de transformações, selecione a pasta que contém os arquivos .xml com uma cópia por arquivo de imagem a ser transformado. Novamente, certifique-se de que a ordem corresponda aos arquivos (ou seja, uma cópia do .xml da rodada 1 para cada canal da rodada 1, uma cópia da .xml da rodada 2 para cada canal da rodada 2, etc.). Clique em OK.Observação : quando concluído, as imagens registradas dessa rodada aparecerão como uma pilha (e na pasta de saída). Use a barra de slides na parte inferior para alternar entre os canais. Verifique se todos os canais foram transformados da mesma forma. Caso contrário, isso provavelmente se deve a um arquivo de .xml incorreto no diretório de transformações; Nesse caso, corrija o arquivo e repita.NOTA: O intervalo de brilho exibido será baseado em um canal, mas isso não afeta as imagens salvas reais, apenas a exibição. Observe que as imagens registradas estão todas alinhadas com sucesso ao longo das rodadas e prontas para análise de sobreposições/downstream.NOTA: Existem maneiras programáticas mais eficientes de realizar o registro para grandes lotes. O método apresentado aqui é apenas um método fácil que não requer programação.

Representative Results

Como validação da identidade organoide cerebral, cortes histológicos de um organoide cerebral maduro (2 meses de idade) foram corados para PAX6 (um marcador de NPCs dorsais23) e SATB2 (um marcador de neurônios maduros, pós-mitóticos da camada superior24). Como esperado, as células PAX6+ estavam presentes no interior do organoide e as células SATB2+ nas camadas superiores (Figura 2). Estes resultados suportam que os organoides cerebrais utilizados eram, de fato, prosencéfalo dorsal, conforme especificado no kit de diferenciação. Para estabelecer a dose-dependência do sistema de transplante organoide cerebral, organoides cerebrais de 2 meses de idade foram injetados com um número crescente de NPCs derivados do EGFP+ iPSC. Uma clara dependência da fluorescência da GFP com a fluorescência da GFP no número de células de entrada estava presente, com detecção consistente do adesivo de EGFP+ em 10.000 células ou acima (Figura 3). A persistência e a migração das NPCs transplantadas foram avaliadas em seguida, acompanhando-se os organoides transplantados ao longo do tempo. Para isso, 50.000 NPCs EGFP+ derivados de iPSC foram transplantados em organoides cerebrais de 2-3 meses de idade gerados a partir da mesma linhagem iPSC. Os organoides injetados e os controles foram imageados para positividade do EGFP nos momentos indicados nos próximos 3-4 meses. Nesta série de transplantes, observamos persistência do local injetado durante todo o período de rastreamento de 4 meses (Figura 4A). Placas adicionais de células EGFP+ apareceram até 9 dias após o transplante e persistiram até o final do estudo (3-4 meses, dependendo do organoide), indicando a migração das células e integração em seus novos locais (Figura 4A). Em uma ampliação maior, observou-se morfologia neural clara com projeções longas para dentro do organoide (Figura 4B), confirmando a integração das células injetadas. Para determinar o status de diferenciação das células injetadas no final da injeção, o organoide rastreado por 4 meses e seu controle foram fixados, incluídos em parafina, cortados em cortes de 15 μm de espessura e montados em lâminas de vidro. Os cortes foram então processados e corados em uma única rodada de coloração fluorescente (EGFP, TUJ1, NESTIN) ou por dois ciclos consecutivos de coloração para adicionar marcadores adicionais (MAP2, GFAP). A coloração inicial de rodada única confirmou a presença de células EGFP+ no local da injeção, incluindo uma mistura de células retendo o status NPC (NESTIN+TUJ1−) e aquelas que se diferenciaram para um destino neural (NESTIN−TUJ1+) (Figura 5). Tanto para os organoides controle quanto para os injetados, muito poucos NPCs NESTIN+ foram observados (a maioria, embora não todos sendo NPCs transplantados com EGFP+ no local da injeção), com a maioria dos neurônios TUJ1+ imaturos-maduros (Figura 5). A coloração de duas rodadas forneceu mais detalhes, revelando neurônios maduros (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) ao redor da maior parte da região externa do organoide, com áreas de neurônios imaturos (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) em direção ao meio (Figura 6A,B). Astrócitos (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) estavam presentes nos organoides injetados e controle e foram intercalados ao redor das bordas externas (Figura 6A,B). O corte para o qual a coloração de dois rounds foi realizada no organoide injetado mostrou uma pequena colônia satélite de células EGFP+ distante do local da injeção que adotou o fenótipo de neurônios maduros (Figura 6B,C). Alguns deles pareciam estar próximos aos astrócitos; no entanto, não havia células EGFP+ com sobreposição completa à coloração GFAP, sugerindo que elas eram adjacentes em vez de gerar os astrócitos propriamente ditos (Figura 6B,C). Figura 1: Modelo de transplante de células marcadas em organoides cerebrais. Visão geral esquemática da geração de células marcadas por transdução lentiviral, seu transplante em organoides cerebrais e rastreamento por imagem de células vivas e imunofluorescência. Abreviação: GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Imunofluorescência dos cortes histológicos mostrando a arquitetura dos organoides precoce e tardio. Um organoide cerebral com 2 meses de idade foi fixado, incluído em parafina, fatiado e corado com PAX6, SATB2 e DAPI. Um corte não corado foi usado para definir o tempo de exposição e integração para evitar um sinal falso-positivo de autofluorescência. As células PAX6+ estavam presentes no interior do organoide, enquanto as células SATB2+ estavam presentes nas camadas superiores. Imagens Z-stack foram obtidas a cada 4,2 μm através de todo o corte de tecido de 15 μm. As seções ópticas foram combinadas usando a opção de empilhamento de foco no software Gen5 com opções padrão. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: PAX6 = proteína caixa 6 pareada; SATB2 = proteína especial de ligação à sequência AT-rica em AT; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Enxertia dose-dependente de NPCs em organoides cerebrais. Os organoides foram transplantados com 0 (controle negativo), 1.000, 5.000, 10.000 ou 50.000 NPCs derivados de GFP+ iPSC. 1 semana após o transplante, os organoides foram fotografados em um Cytation 5 com um cubo de filtro de GFP. O controle negativo foi utilizado para definir o tempo de exposição e integração para minimizar a autofluorescência. Cores mais escuras indicam mais fluorescência EGFP em relação ao controle negativo. Barras de escala = 100 μm. Estas são imagens 4x de todos os organoides. Após a obtenção de imagens, a subtração de fundo da bola rolante com um raio de pixel de 50 foi realizada antes da exibição para corrigir a intensidade de fundo variável nos organoides. Os locais de injeção identificados como as regiões de maior enxertia são indicados com uma seta vermelha onde a enxertia estava presente. Abreviações: NPCs = células progenitoras neurais; GFP = proteína fluorescente verde; FEGP = GFP reforçada; iPSC = células-tronco pluripotentes induzidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Rastreamento do crescimento, migração e persistência de células vivas transplantadas com imagens de células vivas fluorescentes. (A) Organoides de controle e transplantados (50.000 NPCs derivados de GFP+ iPSC) foram seguidos por imagens de células vivas de fluorescência ao longo de 2-4 meses a partir de dois conjuntos de transplantes independentes. Organoides de controle negativo foram usados para definir o tempo de exposição e integração para minimizar a autofluorescência em cada ponto de tempo. As imagens de EGFP foram capturadas usando um cubo de filtro de GFP no Cytation 5 nos horários indicados após o transplante. Cores mais escuras indicam mais fluorescência EGFP em relação ao controle negativo para aquele ponto de tempo. A subtração de fundo da bola rolante com um raio de pixel de 50 foi realizada antes da exibição para corrigir a intensidade de fundo variável nos organoides. Os organoides foram colocados aproximadamente na mesma orientação em cada momento, e as imagens foram giradas para consistência do display e para mostrar claramente o crescimento celular transplantado. Os locais de injeção identificados como as regiões de maior enxertia no momento mais precoce são indicados com uma seta vermelha. Um exemplo de organoide de controle negativo é mostrado na parte inferior da figura. (B) Exemplo de imagens 20x de organoides enxertados na semana 1 e na semana 15 pós-transplante. O contraste local foi melhorado antes da exibição usando FIJI para garantir a visibilidade do neurito. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: NPCs = células progenitoras neurais; GFP = proteína fluorescente verde; FEGP = GFP reforçada; iPSC = células-tronco pluripotentes induzidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Imunofluorescência dos cortes histológicos revelando a persistência das NPCs transplantadas no local da injeção, com migração e diferenciação neural. Imagens de fluorescência de canal único de organoides (A) não injetados e (B) transplantados. A imagem sobreposta à direita mostra os três canais de interesse (NESTIN, TUJ1 e EGFP), mas não inclui DAPI. Os mínimos de exibição foram ajustados para apenas excluir o sinal das células negativas (determinado para EGFP do controle não injetado e para outros canais com base em combinações de marcadores conhecidos). Os máximos de exibição foram baseados no sinal mais alto observado para esse anticorpo em qualquer célula. Os intervalos de exibição foram mantidos constantes entre os organoides não injetados e transplantados para permitir a comparação direta. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: NPCs = células progenitoras neurais; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; TUJ1 = tubulina beta-III; EGFP = proteína fluorescente verde reforçada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Avaliação do estado de diferenciação e localização das células enxertadas por imunofluorescência cíclica dos cortes histológicos. Imagens de fluorescência de canal único dos organoides não injetados, (A) pareados por idade e (B) transplantados são mostradas para a primeira e segunda rodada de coloração, conforme indicado. Os mínimos de exibição foram ajustados para apenas excluir o sinal das células negativas (determinado para EGFP do controle não injetado e para outros canais com base em combinações de marcadores conhecidos). Os máximos de exibição foram baseados no sinal mais alto observado para esse anticorpo em qualquer célula. Os intervalos de exibição (e, claro, os parâmetros de imagem) foram mantidos constantes entre os organoides controle e injetados para permitir a comparação direta. Barras de escala = 100 μm. Uma imagem sobreposta (excluindo DAPI) é mostrada para cada rodada de coloração para cada organoide à direita. (B) Para o organoide injetado onde foi realizado o registro das imagens, todas as imagens são recortadas para a região observada em ambas as rodadas de coloração. (B,C) Para o organoide injetado, as regiões celulares do EGFP+ são delineadas em azul. Um diagrama de como o DAPI é usado para corresponder aos recursos durante o registro da imagem é mostrado em (C), seguido por uma mesclagem geral da imagem registrada. Abreviações: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; TUJ1 = tubulina beta-III; EGFP = proteína fluorescente verde reforçada; MAP2 = proteína 2 associada aos microtúbulos; GFAP = proteína glial fibrilar ácida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Clone Fluoróforo Concentração Anti-NESTINA 10C2 AlexaFluor 594 1 em 2.000 Anti-TUBB3 TUJ1 AlexaFluor 647 1 em 2.000 Anti-GFP FM264G AlexaFluor 488 1 em 200 Anti-GFAP SMI 25 AlexaFluor 594 1 em 500 Anti-MAP2 SMI 52 AlexaFluor 488 1 em 1.000 Anti-PAX6 O18-1330 AlexaFluor 647 1 em 100 Anti-SATB2 EPNCIR130A AlexaFluor 594 1 em 500 Tabela 1: Concentrações de anticorpos para coloração. Abreviações: TUBB3 = beta-tubulina III; GFP = proteína fluorescente verde; GFAP = proteína glial fibrilar ácida; MAP2 = proteína 2 associada aos microtúbulos; PAX6 = proteína caixa 6 pareada; SATB2 = proteína especial de ligação à sequência AT-rica em AT.

Discussion

Dado o significativo interesse em abordagens terapêuticas celulares para o tratamento de lesões do SNC/doenças neurodegenerativas1,2,3,4,5,6,7,8, modelos de função celular em ambiente de transplante vêm ganhando importância. Este trabalho apresenta um método para o transplante de NPCs humanas marcadas em organoides cerebrais humanos, juntamente com seu rastreamento de células vivas e avaliação de desfecho por histologia e coloração por imunofluorescência. É importante ressaltar que mostramos que as células transplantadas foram capazes de migração, diferenciação e persistência a longo prazo (4 meses) no ambiente organoide. Essa persistência em longo prazo representa um aumento acentuado em relação à mantenabilidade das culturas de fatias cerebrais17. Esse sistema é, portanto, apropriado para examinar muitos dos comportamentos que seriam necessários avaliar em um cenário terapêutico potencial, como sobrevivência, proliferação e diferenciação. De fato, um estudo ortogonal demonstrou recentemente que NPCs transplantados se comportaram de forma semelhante em organoides cerebrais em comparação com NPCs transplantados em cérebros de camundongos NSG20, confirmando assim a utilidade dos organoides como receptor de transplante. Como este é um sistema in vitro, também é simples adicionar citocinas ou drogas de interesse. Isso poderia ser usado para entender melhor os efeitos de ambientes específicos, como inflamação e imunossupressores, nas células transplantadas para imitar ainda mais o que elas podem encontrar em um ambiente terapêutico. O protocolo de imunofluorescência cíclica que demonstramos (baseado em pesquisas anteriores21) amplia ainda mais o poder dessa abordagem, permitindo que uma ampla gama de marcadores específicos de linhagem e, potencialmente, doença-específicos sejam avaliados simultaneamente em um único corte e, assim, permitindo o rastreamento preciso das células transplantadas e seu impacto no tecido. Naturalmente, outros métodos de avaliação de desfechos poderiam ser usados em vez disso, dependendo dos objetivos da análise. Por exemplo, a limpeza tecidual com reconstrução 3D poderia ser usada se a morfologia celular for de interesse primário, ou a dissociação seguida de citometria de fluxo poderia ser usada se a quantificação de tipos celulares específicos for o objetivo final. Esperamos que este método seja facilmente extensível a outros tipos celulares, como os tumores do SNC, potencialmente permitindo seu estudo em um contexto microambientalmente relevante. Da mesma forma, os organoides utilizados como receptores poderiam ser trocados por organoides modelo de doença25,26,27, potencialmente permitindo a modelagem de abordagens de transplante para essas condições.

Como acontece com todos os modelos, o apresentado aqui também tem suas próprias limitações. Por um lado, os organoides derivados da iPSC são imaturos no desenvolvimento19 e, portanto, apresentam diferenças importantes em relação ao cérebro envelhecido, no qual muitas doenças neurodegenerativas se manifestam. Os organoides cerebrais também não são uniformes no desenvolvimento19, impossibilitando a injeção consistente no mesmo nicho fisiológico exato. Além disso, embora contenham os tipos celulares das regiões cerebrais relevantes18,19, eles carecem dos componentes endotelial, microglial e imunológico, que também são importantes no cenário in vivo 14. Isso limita o estudo de como o hospedeiro reagirá ao transplante celular. Atualmente, estão sendo disponibilizadas técnicas para adicionar células vasculares28 e microgliais29, bem como aumentar a consistência organoide e regionalização18, melhorando assim o poder de modelagem do sistema de transplante organoide. Eles exigiriam, no entanto, mais testes e otimização além do que é apresentado aqui. Embora esse protocolo seja de baixo custo e não necessite de equipamentos especializados, ainda há uma série de considerações técnicas importantes – a profundidade de injeção, por exemplo. Isso se deve ao fato de que os organoides não são perfundidos e, portanto, muitas vezes têm um centro necrótico se crescerem muito grandes19 e que a luz não pode penetrar através do núcleo organoide para rastreamento de células vivas. Assim, as células que foram injetadas muito profundamente e colônias que migraram para dentro podem ser perdidas. Embora isso possa ser amenizado pelo uso de fluoróforos de comprimento de onda mais longo com melhor penetrância tecidual30, dependendo do tamanho do organoide e do aparelho de detecção, isso provavelmente permanecerá uma consideração. Finalmente, como os organoides cerebrais estão em um estado de desenvolvimento, o momento do transplante é outra consideração fundamental, pois o ambiente provavelmente será diferente dependendo do estágio de desenvolvimento do organoide no qual ele é injetado. Embora isso possa ser controlado até certo ponto, garantindo uma idade organoide consistente no momento da injeção, é, sem dúvida, um fator que precisa ser considerado.

Esse protocolo é barato, simples, livre de animais e não requer equipamentos especializados, tornando a modelagem de transplantes acessível a uma maior variedade de laboratórios. Com o rápido avanço tanto na terapêutica de células neurais quanto em sistemas de modelos organoides, antecipamos que o protocolo de transplante de organoides aqui apresentado será um modelo útil para uma variedade de doenças e abordagens terapêuticas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os fundos para este trabalho foram fornecidos através dos fundos filantrópicos IRIC da fundação Marcelle e Jean Coutu e do Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS #295647). D.J.H.F.K. tem apoio salarial da FRQS na forma de uma bolsa Chercheurs-boursiers Junior 1 (#283502). M.I.I.R. foi apoiado por um IRIC Doctoral Award do Institut of Research in Immunology and Cancer, um Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat da Universidade de Montreal, e Bourse de Mérite aux cycles supérieurs.

Materials

Accutase StemCell Technologies 7920 proteolytic-collagenolytic enzyme mix
Alexa Fluor 488 anti-GFP Antibody BioLegend 338008
Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52) BioLegend 801804
Alexa Fluor 594 anti-GFAP Antibody (clone SMI 25) BioLegend 837510
Alexa Fluor 594 anti-Nestin (clone 10C2) BioLegend 656804
Alexa Fluor 647 anti-Tubulin β 3 (TUBB3) (clone TUJ1) BioLegend 801209
Citric Acid Monohydrate Fisher Chemical A104-500
Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader Biotek –
Denaturated Ethyl Alcohol (Anhydrous) ChapTec –
DMEM F12/Glutamax Thermo 10565018
Dymethil Sulfoxide (DMSO), Sterile BioShop DMS666.100
FIJI 1.53c – –
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Gen5  – –
HistoCore Arcadia H Leica Biosystems –
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Corning 356231 Phenol Red-free, LDEV-free
MX35 microtome blade  Epredia  3053835
NaOH Sigma 655104
PBS (-Ca -Mg) Sigma D8537
Puromycin Dihydrochloride Thermo A1113803
ROCK inhibitor Y-27632 Abcam ab120129
Simport Scientific Stainless-Steel Base Molds Fisher Scientific 22-038-209
Simport Scientific UNISETTE Biopsy Processing/Embedding Cassette Fisher Scientific 36-101-9255
STEMdiff Forebrain Neuron Differentiation Kit StemCell Technologies 8600
STEMdiff Neural Progenitor Medium StemCell Technologies 5833
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit StemCell Technologies 8581
Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome Thermo Scientific –
Tissue Prep Fisher Scientific T555
Tissue-Tek VIP 6  AI Tissue Processor Sakura Finetek –
Toluene (histological) ChapTec –
Trypan blue; 0.4% (wt/vol) Thermo 15250061
Tween 20 BioShop TWN510.100
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References

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Ibanez-Rios, M. I., Narlis, M., Hammond, C. A., Knapp, D. J. H. F. A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (197), e64770, doi:10.3791/64770 (2023).
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