神経細胞移植のヒト大脳オルガノイドモデル

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。 1. レンチウイルス形質導入による細胞の蛍光色素標識 選択した可溶化基底膜マトリックスのアリコートを氷上で解凍します。 アリコートが解凍されている間に、滅菌水を加えて、24ウェルプレートのウェル間の隙間を埋め、外側のすべてのウェルも埋めます。注:これにより、中央に8つのウェルが開いて使用することができ、セルが高湿度に保たれるため、蒸発による変動が最小限に抑えられます。 可溶化した基底膜マトリックスを氷冷DMEM/F12培地で1:100に希釈します(ここで使用したロットで最終濃度0.089 mg/mLが得られました)。 希釈した可溶化基底膜マトリックス300μLを、実施する感染ごとに調製した24ウェルプレートの中間(オープン)ウェルの1つに加えます。ウェルの底全体を均等に覆い、必要に応じてさらに追加して、均一なコーティングを確保してください。 プレートを37°Cで30分間インキュベートし、ウェル底に沿って層を固化させます。このインキュベーションの最後に、液体がまだウェルの底を完全に覆っており、中央で蒸発していないことを確認します。蒸発は湿度が低すぎることを示しています。このような場合は、コーティングを繰り返してください。注:プレートは前日の夜にコーティングし、希釈した可溶化基底膜マトリックスに放置しても、明らかな悪影響はありません。ただし、蒸発の危険性が大幅に高まるため、使用前に慎重に検査する必要があります。 ウェルプレート内で増殖するコンフルエントiPS細胞由来NPCの1つのウェルから培地を除去します。注:この論文では、継代3と継代10の間のメーカーの指示に従って市販キットを使用して作製されたiPS細胞由来の神経前駆細胞を使用しました。 ウェルの側面に1 mLのPBSを静かに加え、プレートを揺り動かして均一に洗浄します。 PBSを除去し、300 μLのタンパク質分解-コラーゲン分解酵素混合物と交換し、再びプレートを揺動させてウェル底部を完全にコーティングします。37°Cで5分間インキュベートします。 細胞がプレート表面から剥離していることを光学顕微鏡で確認します。 P1,000ピペットで、700 μLのDMEM/F12を加え、この混合物をプレート底面のすべての表面にスプレーして細胞を剥離します。ピペットを上下に動かして、細胞凝集体が均一な単一細胞懸濁液に分解されるようにします。細胞を採取し、15 mLの円錐形チューブに9 mLのDMEM/F12培地を加えます。 300 × g で5分間遠心分離します。 この間に、10 μM Y-27632 を添加した培地を、1ウェルあたり500 μL分プレーティング用に十分な量と、再懸濁用に 1 mL を調製します。注:Y-27632は、単細胞として継代した後のNPCの高い生存率を確保するために必要です。 上清を除去し、細胞をY-27632を添加した培地1 mLに再懸濁し、ピペッティングを数回静かに上下させて細胞凝集体を分解します。 数マイクロリットルの細胞を取り出し、トリパンブルーで希釈します(1:5〜1:10)。 血球計算盤で生細胞(トリパンブルー陰性)を数えます。トリパンブルーの希釈率を調整して、血球計算盤の象限ごとに少なくとも50個の生細胞が得られるようにし、カウントが正確であることを確認します。各ウェルに 100,000 個の細胞が存在するのに必要な細胞懸濁液の量を計算します。 ピペッティングで細胞を穏やかに上下に混合し、計算された容量(ウェルあたり100,000細胞の場合)を取ります。これをY-27632を添加した培地(ステップ1.11から)に添加し、最終容量がプレートングするウェルあたり500 μLになるようにします。 希釈した可溶化基底膜マトリックスを、以前にコーティングしたウェルから除去します(30分以上のインキュベーションが完了していると仮定します)。 ピペッティングで細胞を穏やかに混合し、各ウェルに500 μLの細胞懸濁液を加えます。 細胞を均等に分散させるには、細胞培養インキュベーターに入れる直前に、プレートを穏やかな直線的なスイープ(前後、停止、前後)で大きな「+」記号の動きで動かします。 37°C、5%CO2で一晩(16〜24時間)インキュベートします。 培地を取り除き、滴定レンチウイルスを加えます。単一の統合イベントが必要な場合は、細胞あたり0.3感染単位の感染の多様性を目指し(理想的には目的の細胞で滴定)、培地(Y-27632なし)に最大500 μLを補充します。注:関心のあるレンチウイルスは、以前に行われたように、事前に滴定して購入するか、社内で製造することができます22。ここでは、ピューロマイシン耐性を有する自社製GFPレンチウイルスを用いて、EGFPを発現するNPCを作製し、選抜した。レンチウイルスが目的の細胞で滴定されておらず、コピー数が重要な場合は、いくつかのウェルに数容量を追加し、~30%のEGFP+ 細胞を含むウェルを48〜72時間後に使用することをお勧めします。コピー数が重要でない場合は、過剰なウイルスを追加することができますが、挿入突然変異誘発により、一部のクローンで異常な挙動を引き起こす可能性があるという警告があります。注意:レンチウイルスベクターは、レベル2〜3の生物学的危険です(内容によって異なります)。レンチウイルスの取り扱い、表面やプラスチック製品の除染、液体廃棄物については、地域のバイオセーフティ規制に従ってください。 細胞をインキュベーターに戻し、37°C、5%CO2で24時間インキュベートします。 インキュベーターから細胞を取り出し、上清を取り除きます。注意:この時点では、細胞からの上清にレンチウイルス粒子がまだ含まれているため、その取り扱いと廃棄については、引き続き地域のバイオセーフティ規制に従ってください。 ウェルの壁にPBSを静かに添加し、2 x 500 μLのPBSで細胞をすすぎます。次に、ウェルの隅から取り出して、残っているレンチウイルスを洗い流します。注意:この時点では、細胞からの上清にレンチウイルス粒子がまだ含まれているため、その取り扱いと廃棄については、引き続き地域のバイオセーフティ規制に従ってください。 500 μLの新鮮な培地(Y-27632なし)に変更し、37°C、5%CO2 で一晩増殖させ続けます。 生細胞蛍光顕微鏡を使用して、EGFPを発現する細胞の割合を検証し、進行するウェルを選択します。 選択したレンチウイルスベクターに選択カセット(ピューロマイシン耐性などの抗生物質耐性遺伝子)が含まれている場合は、選択剤(ここでは1 μg/mLのピューロマイシン)を、感受性はあるが耐性のない細胞を死滅させる、以前に検証された用量で培地に添加します。そうでない場合は、蛍光活性化セルソーティングを使用して、最初の分割時にEGFP+ 細胞を単離します。 今後は、コンフルエントを毎日モニタリングしながら細胞を維持し、毎日完全な培地交換を行ってください。 コンフルエントに達したら、新しい6ウェルコーティングプレート(希釈した可溶化基底膜マトリックス1 mL;ステップ1.3〜1.5を参照)のウェルを1つ以上調製し、ステップ1.6〜1.15の説明に従って細胞を回収します。注:選択剤が含まれていない場合は、この段階でフローサイトメトリーで細胞をソーティングします。細胞がストレスを最小限に抑えるために十分に広いノズルと低圧で選別されていること、および選別プロセスのすべてのステップに 10 μM Y-27632 が含まれていることを確認してください。 最終密度が200,000細胞/cm2になるように細胞を播種します。 毎日の監視を維持し、毎日メディアの変更を完了します。注:セルが再びコンフルエントに達すると、使用する準備が整います。または、次のようにして、将来の使用のために在庫を凍結できるようになりました。 手順1.6-1.15の説明に従って、セルを分割し、収集し、カウントします。 クライオバイアルのセットに関連情報(継代、EGFP%、ラインなど)を事前にラベル付けします。 400,000細胞/mLの培地+10%DMSOで再懸濁します。注:DMSOは凍結していないと細胞に毒性があるため、DMSOの存在下で室温で過ごす時間は最小限に抑えてください。 クライオバイアルごとにステップ1.33の混合物1 mL(400,000細胞)を加え、細胞凍結容器に入れます。 容器を-80°Cの冷凍庫に一晩移します。 翌日、細胞を液体窒素に移して長期保存します。 2. 脳オルガノイドへの標識細胞注入 注:この論文では、脳オルガノイドは、メーカーの指示に従って市販のキットを使用して製造されました。これは、目的の大脳オルガノイドに置き換えることができます。プロトコルのこの部分で使用される材料は、4°C以上で可溶化された基底膜マトリックスのゲル化を避けるために、事前に冷却する必要があります。 可溶化した基底膜マトリックスと接触させるインスリンシリンシリンジ、チップ、チューブを-20°Cに置き、冷まします。 実施する注入回数に応じて、氷上で可溶化した基底膜マトリックスの適切なサイズのアリコートを融解します(~2 μL/注入)。所要時間は約30分です。 アリコートが解凍されている間に、ステップ1.6-1.15の説明に従って細胞を分割、収穫、およびカウントします。 注入ごとに必要な容量を計算します。複数回注入する場合は、細胞の総量を1.5 mLのチューブに入れ、最大1 mLのDMEM/F12を加えます。注:数回の追加注入が可能な容量は、損失/ピペッティングエラーを考慮するために使用する必要があります。 次のステップを準備している間、細胞を氷に入れます。 融解後、可溶化した基底膜マトリックスを氷冷DMEM/F12で最終濃度3 mg/mLに希釈します。 氷からシングルセル懸濁液を取り出し、300 × g 、4°Cで5分間スピンダウンします。注:冷蔵遠心分離機が利用できない場合、室温での回転は一般的に許容されるようです。 細胞ペレットを乱すことなく、培地を完全に静かに取り除きます。希釈した可溶化基底膜マトリックス(3 mg/mL)に穏やかにピペッティングして細胞ペレットを再懸濁し、実施する注入あたりの最終容量が2 μLになるようにし、使用するまで直ちに氷上に戻します。注:細胞の再懸濁は、気泡の形成やゲル化を避けるために、予冷したチップでゆっくりと行う必要があります。 冷やしたシリンジを-20°Cの冷凍庫からアイスバケットに移します。使用するまで保管してください。 脳オルガノイドの入ったプレートをインキュベーターから取り出します。ワイドボアチップを使用して、注入するオルガノイドを35 mmディッシュに移します。オルガノイドを安定させ、注入を容易にするために、オルガノイドを傷つけることなく、可能な限りすべての培地を除去します。注:オルガノイドを破壊しないように、ワイドボアチップを使用することが重要です。それらが利用できない場合は、滅菌ハサミで通常のP1,000チップの端を切ります。 オルガノイドが入った35 mmのディッシュを解剖顕微鏡の下に置き、注入をガイドし、促進します。注:無菌領域に解剖顕微鏡がない場合は、制御が多少低下しますが、顕微鏡なしで注入を行うことができます。別の代替手段は、拡大ループまたはメガネの使用です。 オルガノイドを注入する準備ができたら、冷やしたP20ピペットチップで細胞を静かに再懸濁し、2 μL(注入する細胞数を含む)を予冷滅滅菌スライドに移します。注:複数回の注入の場合は、スライドガラス全体に2 μLの容量を追加することができます。氷の上に置き、蒸発しないように注意してください。 氷から冷やしたインスリン注射器を取り出し、針の面取りを下に向けて2 μLの細胞懸濁液をゆっくりと吸い上げ、すべての細胞/培地を吸収します。注意: 空気を引き込まないように、極端にゆっくりと進んでください。 オルガノイドが入った皿の蓋を開け、顕微鏡の焦点を合わせます。片手で皿を持ちます。針の斜角を上に置き、もう一方の手で細胞をオルガノイド表面にゆっくりと注入します。注:組織を傷つけないように、ゆっくりと注入することが重要です。 注射後、蓋を皿に戻し、注入したオルガノイドを1〜2分間放置します。注:これにより、希釈された可溶化基底膜マトリックスがゲル化し、細胞を所定の位置に保持できます。培地の添加が早すぎると、表面に付着した細胞が洗い流されてしまう可能性があります。 500 μLのオルガノイド培地を静かに添加し、ワイドボアチップのオルガノイドを24ウェルプレートのウェルに移します。オルガノイドを37°C、5%CO2 で一晩インキュベートします。2日おきに完全な培地交換を行います。注:画像調整に使用されるネガティブコントロールオルガノイド(モック注入)を含めることが重要です。これを行うには、前述のオルガノイドに希釈可溶化基底膜マトリックス(3 mg/mL)を注入し、細胞なしで最終容量の 2 μL を得ます。 3. 生細胞蛍光イメージングによる移植片トラッキング 注:目的の蛍光色素を励起でき、その蛍光を検出するために必要なフィルターセットを備えた蛍光顕微鏡を使用してください。前述したように、ここで使用したNPCはEGFP+で、励起ピークは488 nm、発光ピークは~510 nmでした。 ネガティブコントロールオルガノイド(非注入またはモック注入)をロードし、自家蛍光が最小になるように照明強度と露光時間を設定します。ここで使用した機器では、照明強度を1〜2、露光時間を80ms〜100msに設定しました。注:多くの励起波長(特に低波長)は細胞に毒性を持つ可能性があるため、オルガノイドの損傷を防ぐために、強度を低く保ち、長時間探すことは避けることをお勧めします。 ポジティブコントロールオルガノイドをロードし、必要に応じて曝露時間を増やして、標識細胞がはっきりと見えるようにします。オルガノイドをワイドボアピペットチップで再配置し、注入部位(EGFP+ 領域)を見つけます。 培地をネガティブコントロールオルガノイドから完全に除去します。ネガティブコントロールオルガノイドをロードし、選択した設定でイメージングします(ここで使用した装置では、照明強度を1〜2、露光時間を80ms〜100msに設定しました)。イメージングが完了したら、オルガノイドが乾燥しないように、すぐに新しい培地を加えます。注:培地除去は、浮遊して常に動いているオルガノイドの高さと向きを固定し、高品質のイメージングを妨げるため、良好な画像を得るために重要です。 各試験オルガノイドで培地の除去/イメージングを繰り返します。 オルガノイドを通常のインキュベーション/培地交換(ステップ2.16と同様)に戻し、必要な間隔でイメージングを繰り返します。ここでは、注入後1週目、9週目、16週目にオルガノイドを画像化し、注入したEGFP+ NPCの生存、増殖、分化、および遊走を追跡してテストしました。 4. 組織学および免疫蛍光法 エンドポイントで、オルガノイドを、オルガノイドのIDとその他の必要な識別子で標識された組織学カセットに移します。 カセットに10%ホルマリンを入れ、閉じます。室温で24時間保管してください。 オルガノイドの入ったクローズドカセットを組織プロセスに移し、次のプロトコルを設定します:エタノール70分、エタノール80分、エタノール95分、エタノール100分、エタノール100分、エタノール100分、トルエン30分、トルエン40分、トルエン50分、パラフィン59°Cで25分、パラフィン59°Cで35分、 パラフィンは59°Cで40分、パラフィンは59°Cで50分。注意: 上記の手順は、特に指定がない限り、室温の真空下で行われます。このプロトコルは、水を最大100%のアルコールグラジエントに置き換えます。トルエンとの中間工程は、アルコールとパラフィンの両方が可溶であるため、アルコールとパラフィンの間の遷移です。 注意: トルエンとパラフィンは可燃性の高い液体であり、吸入したり、皮膚や目に触れたりして損傷を引き起こす可能性があるため、危険物と見なされます。必ずしっかりと密閉して安全な場所に保管してください。取り扱いの際は、適切な個人用保護具を着用してください。地域の化学物質危険規制に従って廃棄物を処分してください。 オルガノイドの入ったクローズドカセットを包埋ステーションのパラフィン浴に移します。 カセットを浴槽から取り出して開き、オルガノイドをスチール製のベース型に移します。型をパラフィンディスペンサーの下に置き、パラフィンで完全に覆います。 空のカセットをスチールベース金型の上に置きます。ここで、カセットの上にさらにパラフィンを追加します。 カセットを上にしたスチールベースモールドを氷に移し、5分間冷まします。スチールモールドを取り外し、オルガノイドをパラフィンブロックに埋め込んだカセットを保管します。 カセットをミクロトームに移し、切片を切断します。必要に応じてセクションをカットします。注:ここでは、オルガノイド全体に15μmの厚さの切片を作製しました。 各切片を45°Cに設定したウォーターバスの表面に滴下し、ガラス顕微鏡スライドで拾います。 スライドを42°Cのインキュベーターで一晩乾燥させます。注:スライドは、染色時まで室温で保存できるようになりました。 トルエンを充填したCoplinスライド染色ジャーにスライドを2分間入れます。この手順をもう一度繰り返します。注意: トルエンは可燃性の高い液体であり、吸入したり、皮膚や目に触れたりすることで損傷を引き起こす可能性があるため、危険物と見なされます。必ずしっかりと密閉して安全な場所に保管してください。取り扱いの際は、適切な個人用保護具を着用してください。地域の化学物質危険規制に従って廃棄物を処分してください。 EtOH 100%で満たされたガラス製のCoplinスライド染色ジャーに2分間移します。この手順をもう一度繰り返します。 蒸留水で満たされたガラス製のCoplinスライド染色ジャーに2分間移します。この手順をもう一度繰り返します。 抗原賦活化のために、クエン酸緩衝液(10 mM クエン酸、0.05% Tween 20、pH 6.0)を調製します。注:クエン酸緩衝液は、室温で最大3か月間保存することも、4°Cで長期間保存することもできます。 ウォーターバスを95°Cから100°Cの間に設定します。注意: このウォーターバスは、注意しないと火傷を引き起こす可能性があります。浴槽やその部品に直接触れないように、必要なすべての予防措置を講じてください。 ウォーターバスに、スライドを中に入れることができるプラスチック容器を浮かべます。溶けないように、プラスチックが浴槽の底に触れないようにしてください(底部加熱浴の場合)。プラスチック容器内にクエン酸緩衝液を注ぎ、95〜100°Cに達します。 緩衝液が希望の温度に達したら、スライドを緩衝液の中に置き、容器を蓋でゆるく覆います。スライドを容器内のウォーターバスに30〜40分間放置します。 プラスチック容器をウォーターバスから取り出し、室温でさらに20分間冷まします。 スライドをPBSで3 x 2分間洗浄します。PBSは、サンプルに触れたり、過度に乾燥させたりすることなく、ペーパーティッシュで除去します。 透過処理バッファー(90 mLのPBS + 0.1% Tween-20)を調製し、スライドガラス染色ジャーに充填します。スライドを透過処理バッファーに浸し、10分間インキュベートします。 スライドをPBSで3 x 2分間洗浄します。 各サンプルを覆うのに十分な染色ミックス(~25 μL)を調製します。注:ここで使用した抗体および最終濃度については、 表1 を参照してください。 25 μLの染色ミックスを添加して、各オルガノイドスライスを覆います。室温で1時間、または暗所で4°Cで一晩インキュベートします。注:染色ミックスの蒸発を防ぐために、サンプルを高湿度に保ってください。スライドを湿気に保つための容器が利用できない場合は、隅にウェットティッシュを入れた箱に入れてください。 スライドをPBSで3 x 2分間洗浄します。 スライドガラス染色瓶の中の蒸留水で一度すすぎ、塩分を取り除きます。 各サンプルに10 μLの液体封入液+ 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を加えます。注:2回目の染色を行わない場合は、スライドを密封することができます。ここでは、カバーガラスの除去が組織を損傷する可能性があるため、急冷/再染色のためにスライドを覆っていませんでした。 選択した蛍光顕微鏡を使用してスライドを画像化します。注:強度と露光時間を適切に設定できるように、各抗体のポジティブコントロールとネガティブコントロールを用意してください(ここで使用する装置では、照明強度は5〜6、露光時間は2,000〜3,000msに設定されています)。さらに、使用する各チャンネルに適切な検出器が顕微鏡にあることを確認してください。サンプルは覆われていないため、イメージング中は表向きに配置する必要があることに注意してください。 イメージング後、新しい2倍クエンチングバッファー(PBS中9%H2O2+50mMNaOH)を調製します。 注意: 焼入れ液は、使用する直前に新たに調製する必要があります。反応はH2O2の活性に敏感であり、これは時間の経過とともに減少する。注意:H2O 2は刺激物であり、NaOHは苛性です。これらは適切な安全装置で処理する必要があり、皮膚への接触は避けてください。.地域の化学物質安全ポリシーに従って廃棄されていることを確認してください。 ガラス製のCoplinスライド染色ジャーに2xクエンチングバッファー(45 mL)を半分まで充填し、45 mLのPBSを加えて、スライドを中に入れます。4°Cで一晩インキュベートします。 蛍光顕微鏡で、蛍光色素が効果的に消光されたことを確認します。 上記のように染色とイメージングを繰り返します。注:焼入れと再染色は、必要に応じて追加のラウンドで繰り返すことができますが、追加のラウンドごとに損傷のリスクが増加します。 5. イメージの登録 フィジーを開きます。 ラウンド 1 とラウンド 2 の DAPI 画像を含むフォルダーを作成します。必要に応じて、どちらがどれであるかを明確にするために名前を変更します。 画像登録の出力用に空のフォルダを作成します。 [ プラグイン] |参加登録 |仮想スタックスライスを登録します。 [ソース ディレクトリ] で、各ラウンドの DAPI 画像を含むフォルダーを選択します。 [ 出力ディレクトリ] で、登録出力用に作成したフォルダーを選択します。 [ 特徴抽出モデル ] を [リジッド ] に設定し、[ レジストレーション モデル] ドロップダウン メニューを [リジッド – 移動 + 回転 ] に設定してレジストレーションを修正し、変形ではなく、位置合わせのために画像を移動および回転のみできるようにします。注: 変形が予想される場合は、 特徴抽出モデル と レジストレーション モデル を必要に応じて アフィン または他のモデルに調整できますが、これにより望ましくない変換が発生する可能性があります。時折、ラウンド間でスライスが損傷し、レジストレーションが成功しないことがあります。 Save transforms(トランスフォームを保存 )チェックボックスをオンにしてトランスフォームパラメータを保存し、他のチャンネルに適用できるようにします。 [ OK]をクリックします。 変換ファイルを保存する場所(デフォルトは入力ディレクトリ)を選択し、[開く]をクリックします。 変換の参照として使用する DAPI 画像を選択します。他の各ラウンドのDAPI画像は、このラウンドにアライメントされます。注:完了すると、登録された画像がスタックとして(および出力フォルダーに)表示されます。 下部のスライドバーを使用して画像を前後に切り替え、画像のレジストレーションが成功したことを確認します(少なくとも重なり合う領域では、核は両方の画像で同じ場所にあります)。 入力画像のラウンドごとに.xmlファイルが作成されていることを確認します。注: これらには、そのラウンドのファイルに必要な変換パラメータが含まれています。 登録するすべての画像(各ラウンドの各チャンネル)を含むフォルダーを作成します。ファイルの順序に注意してください。 トランスフォームパラメータ用のフォルダを作成し、登録するチャンネルごとにラウンドごとに.xmlファイルのコピーを1つ作成します。次の手順では、変換パラメーター ファイルの順序で各画像を調べて変換するため、登録する画像と変換パラメーターのコピーの間でファイルの順序 (名前) が同じであることを再確認します。 [ プラグイン] |トランスフォーム |仮想スタックスライスを変換します。 [ソースディレクトリ]で、登録する画像が格納されているフォルダーを選択します。 [ 出力ディレクトリ] で、登録出力用に作成したフォルダーを選択します。 [変換ディレクトリ] で、変換するイメージ ファイルごとに 1 つのコピーを含む.xmlファイルを含むフォルダーを選択します。繰り返しになりますが、順序がファイルと一致していることを確認します(つまり、ラウンド1チャンネルごとにラウンド1.xmlのコピー1つ、ラウンド2チャンネルごとにラウンド2.xmlのコピー1つなど)。 [ OK]をクリックします。注:完了すると、そのラウンドから登録された画像がスタックとして(および出力フォルダーに)表示されます。 下部のスライドバーを使用して、チャンネル間を前後に切り替えます。すべてのチャネルが同じ方法で変換されたことを確認します。そうでない場合は、 transforms ディレクトリ内の .xml ファイルが間違っていることが原因である可能性があります。この場合、ファイルを修正して繰り返します。注意: 表示される輝度範囲は1つのチャンネルに基づいていますが、これは実際に保存された画像には影響せず、ディスプレイにのみ影響します。 レジストレーションされた画像がすべてラウンド間で正常に位置合わせされ、オーバーレイ/ダウンストリーム分析の準備ができていることを確認します。注: 大きなバッチの登録を行うには、より効率的なプログラム方法があります。ここで紹介する方法は、プログラミングを必要としない簡単な方法です。