Burada, etiketli nöral hücrelerin insan serebral organoidlerine nakli ve izlenmesi için bir protokol açıklıyoruz.
Hücre nakli yaklaşımlarının ilerlemesi, nakledilen hücrenin fonksiyonel potansiyelinin doğru bir şekilde değerlendirilmesine izin veren model sistemleri gerektirir. Merkezi sinir sistemi için, ksenotransplantasyon son teknoloji ürünü olmaya devam etse de, bu tür modeller teknik olarak zorlu, verim açısından sınırlı ve pahalıdır. Dahası, mevcut çevresel sinyaller insan hücreleriyle mükemmel bir şekilde çapraz reaksiyona girmez. Bu makale, insan nöral hücrelerinin insan serebral organoidlerine nakli ve izlenmesi için ucuz, erişilebilir ve yüksek verimli uyumlu bir model sunmaktadır. Bu organoidler, ticari kitler kullanılarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden kolayca üretilebilir ve beynin anahtar hücre tiplerini içerir.
Bu nakil protokolünü ilk olarak EGFP etiketli insan iPSC’den türetilmiş nöral progenitör hücrelerin (NPC’ler) bu organoidlere enjeksiyonu ile gösterdik. Daha sonra, canlı hücre floresan mikroskobu ile organoiddeki bu hücrelerin büyümesini izlemek için hususları tartışacağız ve nakledilen EGFP etiketli NPC’lerin 4 aylık bir süre boyunca bir organoidde izlenmesini göstereceğiz. Son olarak, nakledilen hücrelerin kesit alınması, siklik immünofloresan boyama ve lokal bağlamlarında görüntülenmesi için bir protokol sunuyoruz. Burada sunulan organoid transplantasyon modeli, nakledilen insan hücrelerinin ucuz ve gerçekleştirmesi kolay bir protokolle doğrudan bir insan mikro ortamında uzun süreli (en az 4 ay) izlenmesine izin verir. Bu nedenle, hem nöral hücre tedavileri (nakiller) hem de muhtemelen merkezi sinir sistemi (CNS) tümörlerini mikroçevresel olarak daha doğru bir şekilde modellemek için yararlı bir modeli temsil eder.
İnsan beyni, nöral ve glial soyların çoklu hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir organdır. Bunlar birlikte, bilişe yol açan karmaşık bir ağ oluşturur. Travmatik beyin hasarı (TBI)1,2, nörodejeneratif bozukluklar 3,4,5,6,7 ve inme8 dahil olmak üzere çok çeşitli nörolojik bozuklukların tedavisi için hücrelerin bu sisteme transplantasyonuna büyük ilgi vardır. Bununla birlikte, bu tür stratejilerin geliştirilmesindeki önemli bir sınırlama, beklenen transplantasyon sonuçlarını belirlemek için mevcut preklinik modellerin göreceli yetersizliğidir. Şu anda en çok kullanılan modeller, hücre potansiyelini belirlemek için in vitro kültür yöntemleri ve farelere ksenotransplantasyondur. Hücre kültürü yöntemleri, farklılaşmayı ve kendini yenileme potansiyelini9 değerlendirebilirken, bunlar, hücrelerin bir nakil bağlamında karşılaşacağı mikro ortamı taklit etmeyen optimal büyüme koşulları altında gerçekleştirilir. Ayrıca, hücrelerin büyüme şekli davranışlarını etkileyebilir10.
Fare beyinleri, mikroçevrenin tüm hücrelerini içerir ve bu nedenle, transplantasyon için son derece güçlü model sistemlerdir11. Bununla birlikte, fare ve insan korteksi12,13 arasında önemli farklılıklar vardır ve tüm büyüme faktörleri türler arasında çapraz reaksiyona girmez. Primat modelleri, insan sistemini daha iyi taklit eden ve aynı zamanda önemli klinik öncesi sonuçlar veren daha yakın bir alternatiftir14. Bununla birlikte, bu daha yakın akrabalar bile, hücresel yapılarında önemli farklılıklar gösterirler15. Bu model sistemlerin her ikisi de nakil sırasında hücre davranışı hakkında değerli bilgiler sağlarken ve nihai bir tedavinin cerrahi unsurlarını içerirken, kusurlu kalırlar. Aynı zamanda maliyetli ve teknik olarak zorlayıcıdırlar (yani, hayvanlar üzerinde beyin ameliyatı yapılması gerekir), bu nedenle olası verimi sınırlarlar. Ayrıca, insan beyin hücrelerinin hayvanlara nakledilmesiyle ilgili çok sayıda etik sorun vardır16. Beyin dilimi kültürleri, bir beynin kesilmesine ve birden fazla tedavi için kullanılmasına izin verir, böylece hayvan nakillerinin bazı sınırlamalarını ortadan kaldırır; Bununla birlikte, bunların sınırlı ömürleri (haftalar) vardır, hala hayvan kaynaklıdır ve (ince bir dilim olarak) hücrelerin enjeksiyonunu taklit etmek için yeterli hacim/yüzey bütünlüğüne sahip değildir17. Bu nedenle, kesinlikle hücre kültürü/potansiyel modeller ile in vivo transplantasyon arasında önemli bir boşluk vardır.
Serebral organoidler, beyinde bulunan ana nöral hücre tiplerini içeren bir in vitro modeldir ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) yüksek sayıda üretilebilir18,19. Bu tür organoidler, nakil ortamında ilgilenilen bir test hücresinin fonksiyonel kapasitesinin değerlendirilmesine izin verebilecek hücresel bir bağlam sağlar. Gerçekten de, yakın zamanda yapılan bir çalışma, insan serebral organoidlerine nakledilen nöral progenitör hücrelerin (NPC’ler) hayatta kaldığını, çoğaldığını ve obez bir diyabetik fareninbeynine nakledilen NPC’lere benzer şekilde farklılaştığını göstermiştir20. Serebral organoidler bu nedenle insan beyninin hücre tiplerini yakalayan, zulüm içermeyen, uzun ömürlü (>6 ay), uygun maliyetli bir sistemi temsil eder. Bu nedenle, nöral hücrelerin rejeneratif kapasitesinin erken aşama testi için ideal bir nakil alıcısını temsil edebilirler.
Bu makale, etiketli insan NPC’lerinin insan serebral organoidlerine transplantasyonu ve ardından izlenmesi için bir protokol sunmaktadır (Şekil 1). Bu, GFP etiketli NPC’lerin olgun (2-4 aylık) serebral organoidlere enjekte edilmesiyle başlar18. Nakledilen hücreler daha sonra 4 aylık bir süre boyunca canlı hücre floresan mikroskobu ile takip edilir. Bu süre zarfında, hem enjeksiyon bölgesindeki hücrelerin kalıcılığını hem de organoidin distal bölgelerine göçünü gösteriyoruz. Bitiş noktasında, önceki çalışmalara dayanarak ek boyama ve görüntüleme turlarına izin vermek için mevcut AlexaFluor bazlı boyaların söndürülmesi için bir protokol de dahil olmak üzere, bu organoidlerden türetilen histolojik kesitlerin antijen alımını, boyanmasını ve görüntülenmesini gösteriyoruz21. Bu nedenle bu protokol, bir nakil ortamında hücrelerin farklılaşma kapasitesinin, greft dayanıklılığının, yerinde hücre genişlemesinin ve nakil bölgesinden hücre göçünün ölçülmesinde faydalı olabilir. Bunun hem rejeneratif tıp/hücre tedavisi uygulamaları hem de tümör hücrelerini ilgili bölgeye özgü organoidlere aşılayarak tümör modellemesi için faydalı olacağını tahmin ediyoruz.
CNS yaralanmalarının / nörodejeneratif bozuklukların tedavisi için hücre terapötik yaklaşımlarına olan önemli ilgi göz önüne alındığında 1,2,3,4,5,6,7,8, bir nakil ortamında hücre fonksiyon modelleri önem kazanmaktadır. Bu makale, etiketli insan NPC’lerinin insan serebral organoidlerine nakli için bir yöntemin yanı sıra canlı hücre takibi ve histoloji ve immünofloresan boyama ile son nokta değerlendirmesi sunmaktadır. Daha da önemlisi, nakledilen hücrelerin organoid ortamda göç, farklılaşma ve uzun süreli (4 ay) kalıcılık yeteneğine sahip olduğunu gösterdik. Bu tür uzun süreli kalıcılık, beyin dilimi kültürlerinin sürdürülebilirliği üzerinde belirgin bir artıştır17. Bu nedenle, bu sistem, hayatta kalma, çoğalma ve farklılaşma gibi potansiyel bir terapötik ortamda değerlendirilmesi gereken davranışların çoğunu incelemek için uygundur. Gerçekten de, yakın zamanda yapılan bir ortogonal çalışma, nakledilen NPC’lerin, NSG fare beyinlerinenakledilen NPC’lere kıyasla serebral organoidlerde benzer şekilde davrandığını göstermiştir 20, böylece organoidlerin bir nakil alıcısı olarak faydasını doğrulamıştır. Bu bir in vitro sistem olduğundan, sitokinlerin veya ilgilenilen ilaçların eklenmesi de kolaydır. Bu, iltihaplanma ve immünosupresanlar gibi belirli ortamların nakledilen hücreler üzerindeki etkilerini daha iyi anlamak ve terapötik bir ortamda karşılaşabileceklerini daha fazla taklit etmek için kullanılabilir. Gösterdiğimiz döngüsel immünofloresan protokolü (önceki araştırmalaradayanarak 21), bu yaklaşımın gücünü daha da genişleterek, çok çeşitli soy ve potansiyel olarak hastalığa özgü belirteçlerin aynı anda tek bir bölümde değerlendirilmesine izin verir ve böylece nakledilen hücrelerin ve doku üzerindeki etkilerinin doğru bir şekilde izlenmesine izin verir. Tabii ki, analizin hedeflerine bağlı olarak bunun yerine diğer uç nokta değerlendirme yöntemleri kullanılabilir. Örneğin, hücre morfolojisi birincil ilgi alanıysa 3D rekonstrüksiyon ile doku temizleme kullanılabilir veya belirli hücre tiplerinin nicelleştirilmesi nihai hedef ise akış sitometrisi ile ayrışma kullanılabilir. Bu yöntemin, CNS tümörleri gibi diğer hücre tiplerine kolayca genişletilebilir olmasını ve potansiyel olarak mikro-çevre ile ilgili bir bağlamda çalışmalarına izin vermesini bekliyoruz. Benzer şekilde, alıcı olarak kullanılan organoidler, hastalık modeli organoidleri 25,26,27 ile değiştirilebilirve potansiyel olarak bu koşullar için transplantasyon yaklaşımlarının modellenmesine izin verir.
Tüm modellerde olduğu gibi, burada sunulanın da kendi sınırlamaları vardır. Birincisi, iPSC’den türetilen organoidler gelişimsel olarak olgunlaşmamıştır19 ve bu nedenle, birçok nörodejeneratif hastalığın ortaya çıktığı yaşlanan beyne kıyasla önemli farklılıklara sahiptir. Serebral organoidler de gelişimdetekdüze değildir 19, bu nedenle aynı fizyolojik nişe tutarlı enjeksiyonu engeller. Ayrıca, ilgili beyin bölgelerinin hücre tipleriniiçerirken 18,19, in vivo ortamda da önemli olan endotelyal, mikroglial ve bağışıklık bileşenlerinden yoksundurlar14. Bu, konakçının hücre nakline nasıl tepki vereceğinin incelenmesini sınırlar. Vasküler28 ve mikroglial29 hücrelerin eklenmesinin yanı sıra organoid tutarlılığını ve bölgeselleşmeyi18 arttırmak, böylece organoid transplantasyon sisteminin modelleme gücünü geliştirmek için teknikler şu anda çevrimiçi hale geliyor. Bununla birlikte, burada sunulanların ötesinde daha fazla test ve optimizasyon gerektireceklerdir. Bu protokol ucuz olmasına ve özel ekipman gerektirmemesine rağmen, örneğin enjeksiyon derinliği gibi bir dizi önemli teknik husus vardır. Bunun nedeni, hem organoidlerin perfüze edilmemesi hem de bu nedenle, çok büyürlersegenellikle nekrotik bir merkeze sahip olmalarıdır 19 ve bu ışık, canlı hücre takibi için organoid çekirdekten geçemez. Bu nedenle, çok derine enjekte edilen hücreler ve içeri göç eden koloniler gözden kaçabilir. Bu, daha iyi doku penetransına30 sahip daha uzun dalga boylu floroforların kullanılmasıyla iyileştirilebilse de, organoid boyutuna ve tespit aparatına bağlı olarak, bu muhtemelen dikkate alınacaktır. Son olarak, beyin organoidleri gelişme durumunda olduğundan, ortam, enjekte edildiği organoidin gelişim aşamasına bağlı olarak muhtemelen farklılık göstereceğinden, transplantasyon zamanlaması bir diğer önemli husustur. Bu, enjeksiyon sırasında tutarlı bir organoid yaşı sağlanarak bir dereceye kadar kontrol edilebilse de, şüphesiz dikkate alınması gereken bir faktördür.
Bu protokol ucuzdur, basittir, hayvan içermez ve özel ekipman gerektirmez, bu nedenle transplantasyon modellemesini daha geniş bir laboratuvar yelpazesi için erişilebilir hale getirir. Hem nöral hücre terapötiklerinde hem de organoid model sistemlerde hızlı ilerleme hızıyla, burada sunulan organoid transplantasyon protokolünün bir dizi hastalık ve terapötik yaklaşım için yararlı bir model olacağını tahmin ediyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma için fonlar, Marcelle ve Jean Coutu vakfından ve Fonds de recherche du Québec – Santé’den (FRQS #295647) IRIC Hayırsever fonları aracılığıyla sağlandı. D.J.H.F.K., FRQS’den Chercheurs-boursiers Junior 1 bursu (#283502) şeklinde maaş desteğine sahiptir. M.I.I.R., İmmünoloji ve Kanser Araştırmaları Enstitüsü’nden IRIC Doktora Ödülü, Montreal Üniversitesi’nden Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat ve Bourse de Mérite aux cycles supérieurs tarafından desteklendi.
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | proteolytic-collagenolytic enzyme mix |
Alexa Fluor 488 anti-GFP Antibody | BioLegend | 338008 | |
Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52) | BioLegend | 801804 | |
Alexa Fluor 594 anti-GFAP Antibody (clone SMI 25) | BioLegend | 837510 | |
Alexa Fluor 594 anti-Nestin (clone 10C2) | BioLegend | 656804 | |
Alexa Fluor 647 anti-Tubulin β 3 (TUBB3) (clone TUJ1) | BioLegend | 801209 | |
Citric Acid Monohydrate | Fisher Chemical | A104-500 | |
Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | – | |
Denaturated Ethyl Alcohol (Anhydrous) | ChapTec | – | |
DMEM F12/Glutamax | Thermo | 10565018 | |
Dymethil Sulfoxide (DMSO), Sterile | BioShop | DMS666.100 | |
FIJI 1.53c | – | – | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
Gen5 | – | – | |
HistoCore Arcadia H | Leica Biosystems | – | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | Phenol Red-free, LDEV-free |
MX35 microtome blade | Epredia | 3053835 | |
NaOH | Sigma | 655104 | |
PBS (-Ca -Mg) | Sigma | D8537 | |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo | A1113803 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Abcam | ab120129 | |
Simport Scientific Stainless-Steel Base Molds | Fisher Scientific | 22-038-209 | |
Simport Scientific UNISETTE Biopsy Processing/Embedding Cassette | Fisher Scientific | 36-101-9255 | |
STEMdiff Forebrain Neuron Differentiation Kit | StemCell Technologies | 8600 | |
STEMdiff Neural Progenitor Medium | StemCell Technologies | 5833 | |
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | StemCell Technologies | 8581 | |
Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome | Thermo Scientific | – | |
Tissue Prep | Fisher Scientific | T555 | |
Tissue-Tek VIP 6 AI Tissue Processor | Sakura Finetek | – | |
Toluene (histological) | ChapTec | – | |
Trypan blue; 0.4% (wt/vol) | Thermo | 15250061 | |
Tween 20 | BioShop | TWN510.100 |