Aquí, describimos un protocolo para el trasplante y seguimiento de células neuronales marcadas en organoides cerebrales humanos.
El avance de los enfoques de trasplante celular requiere sistemas modelo que permitan una evaluación precisa de la potencia funcional de las células trasplantadas. Para el sistema nervioso central, aunque el xenotrasplante sigue siendo el estado del arte, estos modelos son técnicamente desafiantes, de rendimiento limitado y costosos. Además, las señales ambientales presentes no reaccionan perfectamente con las células humanas. Este artículo presenta un modelo económico, accesible y compatible con el alto rendimiento para el trasplante y seguimiento de células neuronales humanas en organoides cerebrales humanos. Estos organoides se pueden generar fácilmente a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas utilizando kits comerciales y contienen los tipos celulares clave del cerebro.
En primer lugar, demostramos este protocolo de trasplante con la inyección de células progenitoras neurales (NPC) derivadas de iPSC humanas marcadas con EGFP en estos organoides. A continuación, discutimos las consideraciones para rastrear el crecimiento de estas células en el organoide mediante microscopía de fluorescencia de células vivas y demostramos el seguimiento de NPC trasplantadas marcadas con EGFP en un organoide durante un período de 4 meses. Finalmente, presentamos un protocolo para el seccionamiento, tinción inmunofluorescente cíclica e imagen de las células trasplantadas en su contexto local. El modelo de trasplante de organoides que se presenta aquí permite el seguimiento a largo plazo (al menos 4 meses) de las células humanas trasplantadas directamente en un microambiente humano con un protocolo económico y fácil de realizar. Por lo tanto, representa un modelo útil tanto para las terapias de células neurales (trasplantes) como, probablemente, para modelar tumores del sistema nervioso central (SNC) de una manera más precisa desde el punto de vista microambiental.
El cerebro humano es un órgano complejo compuesto por múltiples tipos de células de los linajes neural y glial. Juntos, forman una red sofisticada que da lugar a la cognición. Existe un interés significativo en el trasplante de células en este sistema como tratamiento para una amplia variedad de trastornos neurológicos, incluyendo la lesión cerebral traumática (TCE)1,2, los trastornos neurodegenerativos 3,4,5,6,7 y el accidente cerebrovascular8. Sin embargo, una limitación importante en el avance de estas estrategias es la relativa escasez de modelos preclínicos disponibles para determinar los resultados esperados del trasplante. Los modelos más utilizados en la actualidad son los métodos de cultivo in vitro para determinar el potencial celular y el xenotrasplante en ratones. Si bien los métodos de cultivo celular pueden evaluar la diferenciación y el potencial de autorrenovación9, estos se realizan en condiciones óptimas de crecimiento que no imitan el microambiente que las células encontrarían en un contexto de trasplante. Además, la forma en que se cultivan las células puede influir en su comportamiento10.
Los cerebros de ratón contienen todas las células del microambiente y, por lo tanto, son sistemas modelo extremadamente poderosos para el trasplante11. Sin embargo, existen diferencias importantes entre la corteza del ratón y la del ser humano12,13, y no todos los factores de crecimiento reaccionan de forma cruzada entre especies. Los modelos de primates son una alternativa más cercana que imita mejor el sistema humano y también han arrojado importantes resultados preclínicos14. Sin embargo, incluso estos parientes más estrechamente relacionados conservan diferencias importantes en su composición celular15. Si bien estos dos sistemas modelo proporcionan información valiosa sobre el comportamiento celular durante el trasplante e incorporan los elementos quirúrgicos de una eventual terapia, siguen siendo imperfectos. También son costosos y técnicamente desafiantes (es decir, se debe realizar una cirugía cerebral en los animales), lo que limita el rendimiento posible. Además, hay una gran cantidad de cuestiones éticas asociadas con el trasplante de células cerebrales humanas en animales16. Los cultivos de cortes de cerebro permiten cortar un cerebro y utilizarlo para múltiples tratamientos, eliminando así algunas de las limitaciones de los trasplantes de animales; Sin embargo, estos tienen una vida útil limitada (semanas), todavía son de origen animal y (al ser una rebanada delgada) no tienen suficiente integridad de volumen/superficie para imitar la inyección de células17. Por lo tanto, sigue existiendo una brecha importante entre los modelos estrictamente de cultivo celular/potencial y el trasplante in vivo.
Los organoides cerebrales son un modelo in vitro que contiene los principales tipos de células neurales presentes en el cerebro y pueden generarse en grandes cantidades a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs)18,19. De este modo, estos organoides proporcionan un contexto celular que podría permitir la evaluación de la capacidad funcional de una célula de prueba de interés en el entorno del trasplante. De hecho, un estudio reciente demostró que las células progenitoras neurales (NPC) trasplantadas a organoides cerebrales humanos sobreviven, proliferan y se diferencian de manera similar a las NPC trasplantadas en el cerebro de un ratóndiabético obeso que nuncaha combinado inmunodeficiente gamma (NSG)20. Por lo tanto, los organoides cerebrales representan un sistema rentable, libre de crueldad animal y de larga duración (>6 meses) que captura los tipos de células del cerebro humano. Como tales, podrían representar un receptor de trasplante ideal para las pruebas en etapa temprana de la capacidad regenerativa de las células neuronales.
En este trabajo se presenta un protocolo para el trasplante y posterior seguimiento de NPCs humanas marcadas en organoides cerebrales humanos (Figura 1). Esto comienza con la inyección de NPCs marcadas con GFP en organoides cerebrales maduros (2-4 meses de edad)18. A continuación, las células trasplantadas se someten a una microscopía de fluorescencia de células vivas durante un período de 4 meses. Durante este tiempo, mostramos tanto la persistencia de las células en el lugar de la inyección como la migración a las regiones distales del organoide. En el punto final, demostramos la recuperación de antígenos, la tinción y la obtención de imágenes de secciones histológicas derivadas de estos organoides, incluido un protocolo para el enfriamiento de los colorantes existentes basados en AlexaFluor para permitir rondas adicionales de tinción e imágenes, basado en trabajos anteriores21. Por lo tanto, este protocolo podría ser útil en la medición de la capacidad de diferenciación de las células en un entorno de trasplante, la durabilidad del injerto, la expansión celular in situ y la migración celular desde el sitio del trasplante. Anticipamos que esto será útil tanto para aplicaciones de medicina regenerativa / terapia celular, como para el modelado de tumores mediante el injerto de células tumorales en organoides específicos de regiones relevantes.
Dado el gran interés en los enfoques terapéuticos celulares para el tratamiento de las lesiones del SNC/trastornos neurodegenerativos 1,2,3,4,5,6,7,8, los modelos de función celular en un entorno de trasplante están ganando importancia. En este artículo se presenta un método para el trasplante de NPCs humanas marcadas en organoides cerebrales humanos, junto con su seguimiento de células vivas y la evaluación del punto final mediante histología y tinción inmunofluorescente. Es importante destacar que demostramos que las células trasplantadas eran capaces de migrar, diferenciarse y persistir a largo plazo (4 meses) en el entorno de los organoides. Esta persistencia a largo plazo es un marcado aumento con respecto a la capacidad de mantenimiento de los cultivos de cortes de cerebro17. Este sistema es, por lo tanto, apropiado para examinar muchos de los comportamientos que uno necesitaría evaluar en un entorno terapéutico potencial, como la supervivencia, la proliferación y la diferenciación. De hecho, un estudio ortogonal demostró recientemente que las NPC trasplantadas se comportaron de manera similar en organoides cerebrales en comparación con las NPC trasplantadas en cerebros de ratón NSG20, confirmando así la utilidad de los organoides como receptores de trasplantes. Al tratarse de un sistema in vitro, también es sencillo añadir citoquinas o fármacos de interés. Esto podría utilizarse para comprender mejor los efectos de entornos específicos, como la inflamación y los inmunosupresores, en las células trasplantadas para imitar aún más lo que podrían encontrar en un entorno terapéutico. El protocolo de inmunofluorescencia cíclica que demostramos (basado en investigaciones previas21) amplía aún más el poder de este enfoque, permitiendo que una amplia gama de marcadores específicos de linaje y, potencialmente, de enfermedades se evalúen simultáneamente en una sola sección y, por lo tanto, permitiendo un seguimiento preciso de las células trasplantadas y su impacto en el tejido. Por supuesto, se podrían utilizar otros métodos de evaluación de puntos finales en su lugar, dependiendo de los objetivos del análisis. Por ejemplo, se podría utilizar el aclaramiento de tejidos con reconstrucción 3D si la morfología celular es de interés principal, o se podría utilizar la disociación seguida de citometría de flujo si el objetivo final es la cuantificación de tipos celulares específicos. Esperamos que este método sea fácilmente extensible a otros tipos de células, como los tumores del SNC, lo que podría permitir su estudio en un contexto microambientalmente relevante. De manera similar, los organoides utilizados como receptores podrían intercambiarse por organoides modelo de enfermedad 25,26,27, lo que podría permitir el modelado de enfoques de trasplante para estas condiciones.
Como ocurre con todos los modelos, el que aquí se presenta también tiene sus propias limitaciones. Por un lado, los organoides derivados de iPSC son inmaduros desde el punto de vista del desarrollo19 y, por lo tanto, tienen diferencias importantes en comparación con el cerebro envejecido, en el que se manifiestan muchas enfermedades neurodegenerativas. Los organoides cerebrales tampoco son uniformes en el desarrollo19, lo que impide la inyección consistente en el mismo nicho fisiológico exacto. Además, si bien contienen los tipos celulares de las regiones cerebrales relevantes18,19, carecen de los componentes endoteliales, microgliales e inmunológicos, que también son importantes en el entorno in vivo 14. Esto limita el estudio de cómo reaccionará el huésped al trasplante de células. Actualmente se están poniendo en marcha técnicas para añadir células vasculares28 y microgliales29, así como para aumentar la consistencia y regionalización de los organoides18, mejorando así el poder de modelado del sistema de trasplante de organoides. Sin embargo, requerirían más pruebas y optimización más allá de lo que se presenta aquí. Si bien este protocolo es económico y no requiere equipo especializado, sigue habiendo una serie de consideraciones técnicas importantes, por ejemplo, la profundidad de inyección. Esto se debe al hecho de que los organoides no se perfunden y, por lo tanto, a menudo tienen un centro necrótico si crecen demasiado19 y esa luz no puede penetrar a través del núcleo del organoide para el seguimiento de las células vivas. Por lo tanto, las células que se han inyectado demasiado profundo y las colonias que han migrado al interior pueden pasarse por alto. Si bien esto puede mejorarse mediante el uso de fluoróforos de longitud de onda más larga con una mejor penetrancia tisular30, dependiendo del tamaño del organoide y del aparato de detección, es probable que esto siga siendo una consideración. Finalmente, como los organoides cerebrales se encuentran en un estado de desarrollo, el momento del trasplante es otra consideración clave, ya que el entorno probablemente diferirá según la etapa de desarrollo del organoide en el que se inyecta. Si bien esto se puede controlar hasta cierto punto asegurando una edad constante del organoide en el momento de la inyección, es, sin duda, un factor que debe tenerse en cuenta.
Este protocolo es económico, simple, libre de animales y no requiere equipo especializado, lo que hace que el modelado de trasplante sea accesible para una variedad más amplia de laboratorios. Con el rápido ritmo de avance tanto en la terapéutica de células neurales como en los sistemas modelo de organoides, anticipamos que el protocolo de trasplante de organoides presentado aquí será un modelo útil para una variedad de enfermedades y enfoques terapéuticos.
The authors have nothing to disclose.
Los fondos para este trabajo fueron proporcionados a través de los fondos filantrópicos del IRIC de la fundación Marcelle y Jean Coutu y del Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS #295647). D.J.H.F.K. cuenta con el apoyo salarial de FRQS en forma de una beca Chercheurs-boursiers Junior 1 (#283502). El M.I.I.R. contó con el apoyo de un Premio de Doctorado IRIC del Instituto de Investigación en Inmunología y Cáncer, una Bolsa de Pasaje Accélère de la maitrise au doctorat de la Universidad de Montreal y la Bolsa de Mérito de los Ciclos Superiores.
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | proteolytic-collagenolytic enzyme mix |
Alexa Fluor 488 anti-GFP Antibody | BioLegend | 338008 | |
Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52) | BioLegend | 801804 | |
Alexa Fluor 594 anti-GFAP Antibody (clone SMI 25) | BioLegend | 837510 | |
Alexa Fluor 594 anti-Nestin (clone 10C2) | BioLegend | 656804 | |
Alexa Fluor 647 anti-Tubulin β 3 (TUBB3) (clone TUJ1) | BioLegend | 801209 | |
Citric Acid Monohydrate | Fisher Chemical | A104-500 | |
Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | – | |
Denaturated Ethyl Alcohol (Anhydrous) | ChapTec | – | |
DMEM F12/Glutamax | Thermo | 10565018 | |
Dymethil Sulfoxide (DMSO), Sterile | BioShop | DMS666.100 | |
FIJI 1.53c | – | – | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
Gen5 | – | – | |
HistoCore Arcadia H | Leica Biosystems | – | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | Phenol Red-free, LDEV-free |
MX35 microtome blade | Epredia | 3053835 | |
NaOH | Sigma | 655104 | |
PBS (-Ca -Mg) | Sigma | D8537 | |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo | A1113803 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Abcam | ab120129 | |
Simport Scientific Stainless-Steel Base Molds | Fisher Scientific | 22-038-209 | |
Simport Scientific UNISETTE Biopsy Processing/Embedding Cassette | Fisher Scientific | 36-101-9255 | |
STEMdiff Forebrain Neuron Differentiation Kit | StemCell Technologies | 8600 | |
STEMdiff Neural Progenitor Medium | StemCell Technologies | 5833 | |
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | StemCell Technologies | 8581 | |
Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome | Thermo Scientific | – | |
Tissue Prep | Fisher Scientific | T555 | |
Tissue-Tek VIP 6 AI Tissue Processor | Sakura Finetek | – | |
Toluene (histological) | ChapTec | – | |
Trypan blue; 0.4% (wt/vol) | Thermo | 15250061 | |
Tween 20 | BioShop | TWN510.100 |