JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Een menselijk cerebraal organoïdemodel van neurale celtransplantatie

Published: July 21, 2023
doi:
10.3791/64770
, , ,
1Institut de Recherche en Immunologie et en Cancérologie,Université de Montréal, 2Terry Fox Laboratory,British Columbia Cancer Agency, 3Département de Pathologie et Biologie Cellulaire,Université de Montréal

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor de transplantatie en het volgen van gelabelde neurale cellen in menselijke cerebrale organoïden.

Abstract

De vooruitgang van celtransplantatiebenaderingen vereist modelsystemen die een nauwkeurige beoordeling van de functionele potentie van getransplanteerde cellen mogelijk maken. Voor het centrale zenuwstelsel is xenotransplantatie weliswaar state-of-the-art gebleven, maar dergelijke modellen zijn technisch uitdagend, beperkt in doorvoer en duur. Bovendien reageren de aanwezige omgevingssignalen niet perfect op kruisreacties met menselijke cellen. Dit artikel presenteert een goedkoop, toegankelijk en high-throughput-compatibel model voor de transplantatie en het volgen van menselijke neurale cellen in menselijke cerebrale organoïden. Deze organoïden kunnen gemakkelijk worden gegenereerd uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van commerciële kits en bevatten de belangrijkste celtypen van de grote hersenen.

We demonstreren dit transplantatieprotocol eerst met de injectie van EGFP-gelabelde menselijke iPSC-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC’s) in deze organoïden. Vervolgens bespreken we overwegingen voor het volgen van de groei van deze cellen in de organoïde door middel van fluorescentiemicroscopie van levende cellen en demonstreren we het volgen van getransplanteerde EGFP-gelabelde NPC’s in een organoïde gedurende een periode van 4 maanden. Ten slotte presenteren we een protocol voor de doorsnede, cyclische immunofluorescerende kleuring en beeldvorming van de getransplanteerde cellen in hun lokale context. Het hier gepresenteerde organoïdetransplantatiemodel maakt het mogelijk om getransplanteerde menselijke cellen op lange termijn (ten minste 4 maanden) rechtstreeks in een menselijke micro-omgeving te volgen met een goedkoop en eenvoudig uit te voeren protocol. Het vertegenwoordigt dus een bruikbaar model, zowel voor neurale celtherapieën (transplantaties) als, waarschijnlijk, voor het modelleren van tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) op een meer micro-ecologisch nauwkeurige manier.

Introduction

Het menselijk brein is een complex orgaan dat is samengesteld uit meerdere celtypen van de neurale en gliale lijnen. Samen vormen deze een geavanceerd netwerk dat aanleiding geeft tot cognitie. Er is veel belangstelling voor de transplantatie van cellen in dit systeem als behandeling voor een breed scala aan neurologische aandoeningen, waaronder traumatisch hersenletsel (TBI)1,2, neurodegeneratieve aandoeningen 3,4,5,6,7 en beroerte 8 . Een belangrijke beperking in de vooruitgang van dergelijke strategieën is echter de relatieve schaarste aan beschikbare preklinische modellen om de verwachte transplantatieresultaten te bepalen. De meest gebruikte modellen zijn momenteel in vitro kweekmethoden om celpotentiaal en xenotransplantatie in muizen te bepalen. Hoewel celkweekmethoden differentiatie en zelfvernieuwingspotentieel kunnen beoordelen9, worden deze uitgevoerd onder optimale groeiomstandigheden die niet de micro-omgeving nabootsen die de cellen zouden tegenkomen in een transplantatiecontext. Bovendien kan de manier waarop de cellen worden gekweekt hun gedrag beïnvloeden10.

Muizenhersenen bevatten alle cellen van de micro-omgeving en zijn dus uiterst krachtige modelsystemen voor transplantatie11. Er zijn echter belangrijke verschillen tussen de muis- en menselijke cortex12,13, en niet alle groeifactoren reageren kruiselings tussen soorten. Primatenmodellen zijn een nauwer alternatief dat het menselijk systeem beter nabootst en ook belangrijke preklinische resultaten heeft opgeleverd14. Zelfs deze nauwer verwante verwanten behouden echter belangrijke verschillen in hun cellulaire samenstelling15. Hoewel beide modelsystemen waardevolle inzichten bieden in het gedrag van cellen tijdens transplantatie en de chirurgische elementen van een eventuele therapie bevatten, blijven ze onvolmaakt. Ze zijn ook kostbaar en technisch uitdagend (d.w.z. men moet een hersenoperatie uitvoeren op de dieren), waardoor de mogelijke doorvoer wordt beperkt. Bovendien is er een overvloed aan ethische kwesties verbonden aan het transplanteren van menselijke hersencellen in dieren16. Hersenplakculturen maken het mogelijk om één brein te snijden en te gebruiken voor meerdere behandelingen, waardoor enkele van de beperkingen van diertransplantaties worden weggenomen; Deze hebben echter een beperkte levensduur (weken), zijn nog steeds afkomstig van dieren en hebben (omdat het een dun plakje is) niet voldoende volume/oppervlakte-integriteit om de injectie van cellen na te bootsen17. Er blijft dus een belangrijke kloof bestaan tussen strikt celkweek/potentiaalmodellen en in vivo transplantatie.

Cerebrale organoïden zijn een in vitro model dat de belangrijkste neurale celtypen bevat die in de hersenen aanwezig zijn en kunnen in grote aantallen worden gegenereerd uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s)18,19. Dergelijke organoïden bieden dus een cellulaire context, die het mogelijk zou kunnen maken om de functionele capaciteit van een testcel die van belang is in de transplantatieomgeving te beoordelen. Inderdaad, een recente studie toonde aan dat neurale voorlopercellen (NPC’s) getransplanteerd in menselijke cerebrale organoïden overleven, zich vermenigvuldigen en differentiëren op dezelfde manier als NPC’s die zijn getransplanteerd in de hersenen van een non-zwaarlijvige diabeticus severe gecombineerde immunodeficiënte gamma (NSG) muis20. Cerebrale organoïden vertegenwoordigen dus een dierproefvrij, langlevend (>6 maanden), kosteneffectief systeem dat de celtypen van het menselijk brein vastlegt. Als zodanig zouden ze een ideale ontvanger van transplantaties kunnen zijn voor het testen van het regeneratieve vermogen van neurale cellen in een vroeg stadium.

Dit artikel presenteert een protocol voor de transplantatie en daaropvolgende tracking van gelabelde menselijke NPC’s in menselijke cerebrale organoïden (Figuur 1). Dit begint met de injectie van GFP-gelabelde NPC’s in volwassen (2-4 maanden oude) cerebrale organoïden18. De getransplanteerde cellen worden vervolgens gevolgd door fluorescentiemicroscopie met levende cellen gedurende een periode van 4 maanden. Gedurende deze tijd tonen we zowel de persistentie van cellen op de injectieplaats als de migratie naar distale regio’s van de organoïde. Op het eindpunt demonstreren we het ophalen van antigeen, kleuring en beeldvorming van histologische secties afgeleid van deze organoïden, inclusief een protocol voor het doven van bestaande op AlexaFluor gebaseerde kleurstoffen om extra kleurings- en beeldvormingsrondes mogelijk te maken, gebaseerd op eerder werk21. Dit protocol zou dus nuttig kunnen zijn bij het meten van de differentiatiecapaciteit van cellen in een transplantatieomgeving, de duurzaamheid van het transplantaat, celexpansie in situ en celmigratie van de plaats van de transplantatie. We verwachten dat dit nuttig zal zijn voor zowel regeneratieve geneeskunde/celtherapietoepassingen als tumormodellering door tumorcellen te enten in relevante regiospecifieke organoïden.

Protocol

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt. 1. Fluorofoor labeling van cellen door lentivirale transductie Ontdooi een aliquot van de opgeloste basaalmembraanmatrix naar keuze op ijs. Terwijl het aliquot ontdooit, voeg je steriel water toe om de openingen tussen de putten in een plaat met 24 putjes op te vullen, samen met alle buitenste putjes.OPMERKING: Dit laat acht putten in het midden open voor gebruik en zorgt ervoor dat de cellen in een hoge luchtvochtigheid blijven, waardoor door verdamping veroorzaakte variabiliteit wordt geminimaliseerd. Verdun de opgeloste basaalmembraanmatrix 1:100 in ijskoud DMEM/F12-medium (een eindconcentratie van 0,089 mg/ml werd verkregen met de hier gebruikte partij). Voeg 300 μL van de verdunde opgeloste basaalmembraanmatrix toe aan een van de middelste (open) putjes van de voorbereide plaat met 24 putjes per uit te voeren infectie. Zorg ervoor dat u de hele bodem van de put gelijkmatig bedekt en voeg indien nodig meer toe om een gelijkmatige coating te garanderen. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C om een laag langs de bodem van de put te laten stollen. Controleer aan het einde van deze incubatie of de vloeistof de bodem van de put nog steeds volledig bedekt en niet in het midden is verdampt. Verdamping is een teken dat de luchtvochtigheid te laag is; Als dit gebeurt, herhaal dan de coating.OPMERKING: De platen kunnen de avond ervoor worden gecoat en in verdunde opgeloste basaalmembraanmatrix worden achtergelaten zonder duidelijke nadelige gevolgen; Het risico op verdamping is echter sterk verhoogd, dus ze moeten voor gebruik zorgvuldig worden geïnspecteerd. Verwijder het medium uit een put met confluente iPSC-afgeleide NPC’s die in een putplaat groeien.OPMERKING: Voor dit artikel werden iPSC-afgeleide neurale voorlopercellen gebruikt die zijn geproduceerd met behulp van een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant tussen doorgang 3 en doorgang 10. Voeg voorzichtig 1 ml PBS toe aan de zijkant van het putje en schud het bord om een gelijkmatige wasbeurt te garanderen. Verwijder de PBS en vervang deze door 300 μL van het proteolytisch-collagenolytische enzymmengsel, waarbij u de plaat opnieuw schudt om ervoor te zorgen dat de bodem van de put volledig bedekt is. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Controleer met lichtmicroscopie of de cellen loskomen van het plaatoppervlak. Voeg met een P1.000-pipet 700 μL DMEM/F12 toe en maak de cellen los door dit mengsel over alle oppervlakken van de bodem van de plaat te spuiten. Pipeteer op en neer om ervoor te zorgen dat de celaggregaten worden opgesplitst in een uniforme eencellige suspensie. Neem de cellen op en voeg toe aan 9 ml DMEM/F12-medium in een conisch buisje van 15 ml. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 min. Bereid gedurende deze tijd voldoende medium aangevuld met 10 μM Y-27632 voor 500 μl per te plateren putje, plus 1 ml voor hersuspensie.OPMERKING: Y-27632 is nodig om een hoge overleving van de NPC’s te garanderen na passage als afzonderlijke cellen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml Y-27632-verrijkt medium, waarbij u meerdere keren zachtjes op en neer pipettert om de celaggregaten te breken. Haal een paar microliter cellen eruit en verdun ze (1:5 tot 1:10) in trypanblauw. Tel de levensvatbare (trypan blauw-negatieve) cellen op een hemocytometer. Pas de trypanblauwe verdunning aan om ten minste 50 levensvatbare cellen per kwadrant van de hemocytometer te krijgen om ervoor te zorgen dat de tellingen nauwkeurig zijn. Bereken het volume van de celsuspensie die nodig is om 100.000 cellen in elk putje aanwezig te laten zijn. Meng de cellen voorzichtig op en neer door te pipetteren en neem het berekende volume op (voor 100.000 cellen per putje). Voeg dit toe aan het met Y-27632 gesupplementeerde medium (uit stap 1.11), zodat het uiteindelijke volume 500 μL per te plateren putje is. Verwijder de verdunde opgeloste basaalmembraanmatrix uit de eerder gecoate putjes (ervan uitgaande dat de incubatie van 30 minuten of langer is voltooid). Meng de cellen voorzichtig door te pipetteren en voeg 500 μL van de celsuspensie toe aan elk putje. Om de cellen gelijkmatig te verdelen, beweegt u de plaat in een grote “+”-tekenbeweging met zachte lineaire bewegingen (vooruit-achter, stop, achter-weer) onmiddellijk voordat u deze in een celkweekincubator plaatst. ‘s Nachts (16-24 uur) incuberen bij 37 °C en 5% CO2 . Verwijder het medium en voeg het getitreerde lentivirus toe. Als enkelvoudige integratiegebeurtenissen vereist zijn, streef dan naar een multipliciteit van infectie van 0,3 infectieuze eenheden per cel (idealiter getitreerd op de cellen van belang) en vul aan tot 500 μL in medium (zonder Y-27632).OPMERKING: Het lentivirus van belang kan vooraf getitreerd worden gekocht of in eigen huis worden geproduceerd, zoals eerder gedaan22. Hier werd een in eigen huis geproduceerd GFP-lentivirus met puromycineresistentie gebruikt om de NPC’s die EGFP tot expressie brengen te genereren en te selecteren. Als het lentivirus niet is getitreerd op de cellen van belang en het kopienummer kritisch is, is het aan te raden om meerdere volumes toe te voegen aan een paar putjes en om later het putje met ~30% EGFP+ cellen 48-72 uur te gebruiken. Als het aantal kopieën niet kritisch is, kan overtollig virus worden toegevoegd met het voorbehoud dat insertionele mutagenese kan leiden tot afwijkend gedrag bij sommige klonen. LET OP: Lentivirale vectoren vormen een biologisch gevaar van niveau 2-3 (afhankelijk van hun inhoud). Volg de lokale bioveiligheidsvoorschriften voor het omgaan met het lentivirus, de ontsmetting van oppervlakken en plastic en vloeibaar afval. Plaats de cellen terug in de incubator en incubeer ze gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 . Verwijder de cellen uit de couveuse en verwijder het supernatant.LET OP: Aangezien het supernatans van de cellen op dit moment nog steeds lentivirale deeltjes bevat, moet u de lokale bioveiligheidsvoorschriften blijven volgen voor het hanteren en verwijderen ervan. Spoel de cellen met 2 x 500 μL PBS door PBS voorzichtig aan de wand van de put toe te voegen; Haal vervolgens uit de hoek van de put om het resterende lentivirus weg te spoelen.LET OP: Aangezien het supernatans van de cellen op dit moment nog steeds lentivirale deeltjes bevat, moet u de lokale bioveiligheidsvoorschriften blijven volgen voor het hanteren en verwijderen ervan. Stap over op 500 μL vers medium (zonder Y-27632) en blijf ‘s nachts groeien bij 37 °C en 5% CO2 . Gebruik fluorescentiemicroscopie met levende cellen om het aandeel cellen te verifiëren dat EGFP tot expressie brengt en selecteer het putje waarmee u verder wilt gaan. Als de lentivirale vector naar keuze een selectiecassette bevat (antibioticaresistentiegen zoals puromycineresistentie), voeg dan het selectiemiddel (hier 1 μg/ml puromycine) toe aan het medium in een vooraf gevalideerde dosis die gevoelige maar niet resistente cellen doodt. Gebruik anders fluorescentie-geactiveerde celsortering om de EGFP+ -cellen te isoleren op het moment van de eerste splitsing. Onderhoud vanaf nu de cellen met dagelijkse controle op samenvloeiing en voer dagelijks volledige mediumveranderingen uit. Wanneer de confluentie is bereikt, bereidt u een of meer putjes van een verse 6-well gecoate plaat (met 1 ml verdunde opgeloste basaalmembraanmatrix; zie stappen 1.3-1.5) en oogst u de cellen zoals beschreven in de stappen 1.6-1.15.OPMERKING: Als er geen selectiemiddel is opgenomen, sorteer de cellen dan in dit stadium op flowcytometrie. Zorg ervoor dat de cellen worden gesorteerd met een voldoende breed mondstuk en lage druk om stress te minimaliseren, en dat bij elke stap in het sorteerproces 10 μM Y-27632 wordt opgenomen. Plaat de cellen tot een uiteindelijke dichtheid van 200.000 cellen/cm2. Handhaaf de dagelijkse monitoring en voltooi dagelijks mediumwisselingen.OPMERKING: Wanneer de cellen weer samenvloeien, zijn ze nu klaar voor gebruik. Als alternatief kan een voorraad nu als volgt worden ingevroren voor toekomstig gebruik. Splits, oogst en tel de cellen zoals beschreven in stap 1.6-1.15. Label een set cryovials vooraf met de relevante informatie (bijv. passage, EGFP%, lijn). Resuspenderen bij 400.000 cellen/ml in medium + 10% DMSO.OPMERKING: DMSO is giftig voor cellen wanneer het niet wordt ingevroren, dus minimaliseer de tijd die bij kamertemperatuur wordt doorgebracht in aanwezigheid van DMSO. Voeg 1 ml (400.000 cellen) van het mengsel uit stap 1.33 per cryovial toe en doe het in een celbevriezingscontainer. Breng de container een nacht over naar een vriezer van -80 °C. Breng de cellen de volgende dag over in vloeibare stikstof voor langdurige opslag. 2. Gelabelde celinjectie in de hersenorganoïde OPMERKING: Voor dit artikel zijn cerebrale organoïden geproduceerd met behulp van een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant. Dit kan worden vervangen door de cerebrale organoïde van belang. De materialen die in dit deel van het protocol worden gebruikt, moeten worden voorgekoeld om te voorkomen dat de opgeloste basaalmembraanmatrix bij meer dan 4 °C wordt geleerd. Plaats de insulinespuit(en), tips en buisjes die in contact komen met de opgeloste basaalmembraanmatrix bij -20 °C om ze te laten afkoelen. Ontdooi een aliquot van geschikte grootte opgeloste basale membraanmatrix op ijs, afhankelijk van het aantal injecties dat zal worden uitgevoerd (~2 μL/injectie). Dit duurt ongeveer 30 min. Terwijl het aliquot ontdooit, splitsen, oogsten en tellen van de cellen zoals beschreven in stap 1.6-1.15. Bereken de benodigde volumes per injectie. Als u meerdere injecties doet, plaatst u het totale volume cellen in een buisje van 1,5 ml en voegt u maximaal 1 ml DMEM/F12 toe.OPMERKING: Een volume dat een paar extra injecties mogelijk maakt, moet worden gebruikt om rekening te houden met verliezen/pipetteerfouten. Plaats de cellen in ijs terwijl de volgende stappen worden voorbereid. Verdun na ontdooien de opgeloste basaalmembraanmatrix tot een eindconcentratie van 3 mg/ml in ijskoude DMEM/F12. Neem de eencellige suspensie van het ijs en draai deze gedurende 5 minuten bij 4 °C tot 300 × g .NOTITIE: Als er geen gekoelde centrifuge beschikbaar is, lijkt centrifugeren bij kamertemperatuur over het algemeen te worden getolereerd. Verwijder het medium voorzichtig volledig zonder de celpellet te verstoren. Resuspendeer de celpellet door voorzichtig pipetteren in de verdunde opgeloste basaalmembraanmatrix (3 mg/ml) om een eindvolume van 2 μl per uit te voeren injectie te verkrijgen, en plaats het onmiddellijk terug op ijs tot gebruik.OPMERKING: De resuspensie van de cellen moet langzaam en met voorgekoelde tips worden uitgevoerd om de vorming van luchtbellen en geleren te voorkomen. Breng de voorgekoelde spuit(en) uit de vriezer van -20 °C over in een ijsemmer. Bewaar ze daar tot gebruik. Haal het plaatje met de hersenorganoïden uit de couveuse. Gebruik een brede punt om de te injecteren organoïde over te brengen in een schaal van 35 mm. Verwijder al het mogelijke medium zonder de organoïde te beschadigen om deze te stabiliseren en de injectie te vergemakkelijken.OPMERKING: Het is belangrijk om tips met een brede diameter te gebruiken om te voorkomen dat de organoïde wordt vernietigd. Als ze niet beschikbaar zijn, knip dan het uiteinde van een gewone P1,000-punt af met een steriele schaar. Plaats de schaal van 35 mm met de organoïde onder een ontleedmicroscoop om de injectie te geleiden en te vergemakkelijken.OPMERKING: Als er geen ontleedmicroscoop beschikbaar is in een steriele ruimte, is het mogelijk om de injectie zonder microscoop uit te voeren, zij het met iets minder controle. Een ander alternatief is het gebruik van een vergrotingslus of bril. Zodra de organoïde(n) klaar zijn om te worden geïnjecteerd, resuspendeert u de cellen voorzichtig met een gekoelde P20-pipetpunt en verplaatst u 2 μL (met het gewenste aantal te injecteren cellen) op een voorgekoeld steriel glasplaatje.OPMERKING: Voor meerdere injecties kunnen extra volumes van 2 μL over het glasglaasje worden toegevoegd. Bewaar het op ijs en zorg ervoor dat het niet verdampt. Neem een voorgekoelde insulinespuit uit het ijs en zuig langzaam de 2 μL celsuspensie op met de schuine kant van de naald naar beneden gericht, zodat alle cellen/medium kunnen worden opgenomen.NOTITIE: Zorg ervoor dat u extreem langzaam gaat om te voorkomen dat u lucht aanzuigt. Open het deksel van de schaal met de organoïde en richt de microscoop erop. Houd de schaal met één hand vast. Plaats de schuine kant van de naald omhoog en injecteer met de andere hand de cellen langzaam in het organoïde-oppervlak.OPMERKING: Het is belangrijk om langzaam te injecteren om beschadiging van het weefsel te voorkomen. Plaats na de injectie het deksel terug in de schaal en laat de geïnjecteerde organoïde 1-2 minuten staan.OPMERKING: Hierdoor kan de verdunde opgeloste basaalmembraanmatrix geleren, waardoor de cellen op hun plaats worden gehouden. Als het medium te vroeg wordt toegevoegd, kan het de cellen aan het oppervlak wegspoelen. Voeg voorzichtig 500 μL van het organoïdemedium toe en breng de organoïde met een brede punt over in een putje met een plaat met 24 putjes. Incubeer de organoïde bij 37 °C en 5% CO2 ‘ s nachts. Voer om de dag volledige mediumwisselingen uit.OPMERKING: Het is belangrijk om een negatieve controleorganoïde (nepgeïnjecteerd) op te nemen, die zal worden gebruikt voor beeldvormingsaanpassingen. Injecteer hiervoor een organoïde zoals eerder beschreven met verdunde opgeloste basaalmembraanmatrix (3 mg/ml) om een eindvolume van 2 μL zonder cellen te verkrijgen. 3. Transplantaattracering door middel van fluorescentiebeeldvorming met levende cellen NOTITIE: Gebruik een fluorescentiemicroscoop die de fluorofoor van belang kan prikkelen en die het filter heeft dat nodig is om de fluorescentie te detecteren. Zoals eerder vermeld, waren de NPC’s die hier werden gebruikt EGFP+, met een excitatiepiek van 488 nm en een emissiepiek van ~510 nm. Laad een negatieve controleorganoïde (niet-geïnjecteerd of nepgeïnjecteerd) en stel de verlichtingsintensiteit en belichtingstijd zo in dat autofluorescentie minimaal is. Voor het hier gebruikte instrument werd de verlichtingsintensiteit ingesteld tussen 1 en 2 en de belichtingstijd tussen 80 ms en 100 ms.OPMERKING: Omdat veel excitatiegolflengten (met name lagere golflengten) giftig kunnen zijn voor cellen, wordt aanbevolen om de intensiteit laag te houden en niet te lang te zoeken om schade aan de organoïde te voorkomen. Laad de organoïde van de positieve controle en verhoog indien nodig de blootstellingstijd om ervoor te zorgen dat de gelabelde cellen duidelijk zichtbaar zijn. Verplaats de organoïde met een pipetpunt met brede diameter om de injectieplaats te vinden (EGFP+ -gebied). Verwijder het medium volledig uit de negatieve controleorganoïde. Laad de negatieve controleorganoïde en breng deze in beeld met de geselecteerde instellingen (voor het hier gebruikte instrument werd de verlichtingsintensiteit ingesteld tussen 1 en 2 en de belichtingstijd tussen 80 ms en 100 ms). Wanneer de beeldvorming is voltooid, voegt u onmiddellijk vers medium toe om te voorkomen dat de organoïde uitdroogt.OPMERKING: Mediumverwijdering is van cruciaal belang voor het verkrijgen van een goed beeld, omdat het de hoogte en oriëntatie van de organoïden fixeert, die anders zweven en constant in beweging zijn, waardoor beeldvorming van hoge kwaliteit wordt uitgesloten. Herhaal de verwijdering van het medium/beeldvorming met elk van de testorganoïden. Breng de organoïden terug naar normale incubatie-/mediumveranderingen (zoals in stap 2.16) en herhaal de beeldvorming met de gewenste tussenpozen. Hier werden de organoïden in week 1, week 9 en week 16 na injectie in beeld gebracht om de overleving, proliferatie, differentiatie en migratie van de geïnjecteerde EGFP+ NPC’s te volgen en te testen. 4. Histologie en immunofluorescentie Breng de organoïde op het eindpunt over naar een histologiecassette die is gelabeld met de ID van de organoïde en andere noodzakelijke identificatiemiddelen. Vul de cassette met 10% formaline en sluit deze. Bewaar het 24 uur op kamertemperatuur. Breng de gesloten cassette met de organoïde over naar een weefselproces en stel het volgende protocol in: ethanol 70% 10 min, ethanol 80% 20 min, ethanol 95% 30 min, ethanol 100% 30 min, ethanol 100% 40 min, ethanol 100% 50 min, tolueen 30 min, tolueen 40 min, tolueen 50 min, paraffine 25 min bij 59 °C, paraffine 35 min bij 59 °C, paraffine 40 min bij 59 °C, paraffine 50 min bij 59 °C.NOTITIE: De bovenstaande stappen worden uitgevoerd onder vacuüm bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Dit protocol vervangt het water door gradiënten van alcohol tot 100%. De tussenstap met tolueen is een overgang tussen de alcohol en paraffine, omdat beide daarin oplosbaar zijn. LET OP: Tolueen en paraffine worden als gevaarlijke stoffen beschouwd omdat ze licht ontvlambare vloeistoffen kunnen zijn en schade kunnen veroorzaken bij inademing of contact met de huid of ogen. Zorg ervoor dat u ze goed gesloten bewaart in een veilige ruimte. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren ervan. Gooi afval weg in overeenstemming met de plaatselijke voorschriften voor chemische gevaren. Breng de gesloten cassette met de organoïde over in een paraffinebad in het inbeddingsstation. Haal de cassette uit het bad, open hem en breng de organoïde over in een stalen basisvorm. Plaats de vorm onder de paraffinedispenser en bedek deze volledig met paraffine. Plaats de lege cassette op de bovenkant van de stalen basismal. Voeg hier meer paraffine toe aan de bovenkant van de cassette. Breng de stalen basisvorm met de cassette erop over in ijs en laat deze 5 minuten afkoelen. Verwijder de stalen mal en bewaar de cassette met de organoïde ingebed in een paraffineblok. Breng de cassette over in een microtoom om secties te snijden. Snijd secties naar wens.OPMERKING: Hier werden secties van 15 μm dikte door de hele organoïde gemaakt. Laat elke sectie op het oppervlak van een waterbad op 45 °C vallen en pak het op een glazen microscoopglaasje. Laat de objectglaasjes een nacht drogen in een incubator bij 42 °C.NOTITIE: De objectglaasjes kunnen nu bij kamertemperatuur worden bewaard tot het moment van kleuren. Plaats het glaasje gedurende 2 minuten in een Coplin-kleurpot gevuld met tolueen. Herhaal deze stap nog een keer.LET OP: Tolueen wordt als een gevaarlijk materiaal beschouwd omdat het een licht ontvlambare vloeistof kan zijn en schade kan veroorzaken door inademing of contact met de huid of ogen. Zorg ervoor dat u het goed gesloten opbergt in een veilige ruimte. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren ervan. Gooi afval weg in overeenstemming met de plaatselijke voorschriften voor chemische gevaren. Breng over naar een glazen Coplin-kleurpot gevuld met EtOH 100% gedurende 2 min. Herhaal deze stap nog een keer. Breng over naar een glazen Coplin-kleurpot gevuld met gedestilleerd water gedurende 2 minuten. Herhaal deze stap nog een keer. Voor het ophalen van antigeen citraatbuffer bereiden (10 mM citroenzuur, 0,05% Tween 20, pH 6,0).OPMERKING: Citraatbuffer kan maximaal 3 maanden bij kamertemperatuur worden bewaard of bij 4 °C voor langere opslag. Stel een waterbad in tussen 95 °C en 100 °C.LET OP: Dit waterbad kan brandwonden veroorzaken als men niet voorzichtig is. Neem alle nodige voorzorgsmaatregelen om direct contact met het bad of de onderdelen ervan te vermijden. Laat in het waterbad een plastic bak drijven waarin de glijbanen passen. Zorg ervoor dat het plastic de bodem van het bad niet raakt (ervan uitgaande dat het een bodemverwarmingsbad is) om smelten te voorkomen. Giet de citraatbuffer in de plastic container en laat deze 95-100 °C bereiken. Zodra de buffer de gewenste temperatuur heeft bereikt, plaatst u de glaasjes in de buffer en dekt u de container losjes af met een deksel. Laat de glaasjes in de container 30-40 minuten in het waterbad staan. Haal het plastic bakje uit het waterbad en laat het nog 20 minuten afkoelen op kamertemperatuur. Was de glaasjes 3 x 2 min met PBS. Verwijder de PBS met een papieren zakdoekje zonder het monster aan te raken of uit te drogen. Bereid de permeabilisatiebuffer voor (90 ml PBS + 0,1% Tween-20) en vul er een glazen kleurpotje mee. Dompel de objectglaasjes onder in de permeabilisatiebuffer en incubeer gedurende 10 minuten. Was de glaasjes 3 x 2 min met PBS. Bereid voldoende kleurstof voor elk monster (~25 μL).OPMERKING: Zie tabel 1 voor de antilichamen en de uiteindelijke concentraties die hier worden gebruikt. Voeg 25 μL kleurstof toe om elke plak organoïde te bedekken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of een nacht bij 4 °C in het donker.NOTITIE: Zorg ervoor dat de monsters op een hoge luchtvochtigheid blijven om verdamping van het kleurmengsel te voorkomen. Als er geen container beschikbaar is om de glaasjes vochtig te houden, doe ze dan in een doos met wat natte tissues op de hoek. Was de glaasjes 3 x 2 min met PBS. Spoel eenmaal af met gedestilleerd water in een glazen kleurpot om het zout te verwijderen. Voeg 10 μL vloeibaar montproduct + 4’,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe aan elk van de monsters.OPMERKING: De objectglaasjes kunnen worden verzegeld als er geen tweede kleuringsronde wordt uitgevoerd. Hier werden de objectglaasjes niet afgedekt om toegang te bieden voor blussen/opnieuw vlekken, omdat het verwijderen van dekglaasjes het weefsel kan beschadigen. Breng de objectglaasjes in beeld met de geselecteerde fluorescentiemicroscoop.OPMERKING: Zorg ervoor dat u positieve en negatieve controles heeft voor elk antilichaam om de juiste instelling van de intensiteiten en belichtingstijden mogelijk te maken (voor het hier gebruikte instrument is de verlichtingsintensiteit ingesteld tussen 5 en 6 en de belichtingstijd tussen 2.000 ms en 3.000 ms), hoewel dit kan variëren afhankelijk van het antilichaam. Zorg er bovendien voor dat de microscoop voldoende detectoren heeft voor elk gebruikt kanaal. Houd er rekening mee dat, aangezien de monsters niet bedekt zijn, ze met de voorkant naar boven moeten worden geplaatst terwijl ze worden afgebeeld. Bereid na beeldvorming 2x een nieuwe blusbuffer (9% H2O2 + 50 mM NaOH in PBS).NOTITIE: De blusoplossing moet onmiddellijk voor gebruik vers worden bereid. De reactie is gevoelig voor de activiteit van de H2O2, die in de loop van de tijd zal afnemen. LET OP: H2O2 is irriterend en NaOH is bijtend. Deze moeten worden behandeld met geschikte veiligheidsuitrusting en huidcontact moet worden vermeden. Zorg ervoor dat ze worden weggegooid in overeenstemming met het lokale chemische veiligheidsbeleid. Vul de glazen Coplin-kleurpot voor de helft met 2x blusbuffer (45 ml), voeg 45 ml PBS toe en doe de glaasjes erin. Incubeer een nacht bij 4 °C. Controleer met fluorescentiemicroscopie of de fluoroforen effectief zijn geblust. Herhaal de kleuring en beeldvorming zoals hierboven.OPMERKING: Het blussen en opnieuw markeren kan indien nodig worden herhaald voor extra rondes, hoewel het risico op schade met elke extra ronde toeneemt. 5. Beeldregistratie FIJI openen. Maak een map met de DAPI beelden van ronde 1 en ronde 2. Wijzig indien nodig de namen om te verduidelijken welke welke is. Maak een lege map voor de uitvoer van de beeldregistratie. Klik op Plug-ins | Registratie | Registreer Virtual Stack Slices. Selecteer onder Bronmap de map met de DAPI-afbeeldingen van elke ronde. Selecteer onder Uitvoermap de map die is gemaakt voor de registratieuitvoer. Stel het model voor het extraheren van objecten in op Rigide en het vervolgkeuzemenu Registratiemodel op Rigide – vertalen + roteren om de registratie te corrigeren, waarbij de afbeelding alleen kan worden verplaatst en geroteerd voor uitlijning in plaats van te worden vervormd.OPMERKING: Als vervorming wordt verwacht, kunnen het kenmerkextractiemodel en het registratiemodel naar wens worden aangepast aan Affine of andere modellen, hoewel dit kan leiden tot ongewenste transformaties. Af en toe kan een plak tussen de rondes door beschadigd raken, wat een succesvolle registratie in de weg kan staan. Vink het vakje Transformaties opslaan aan om de transformatieparameters op te slaan, zodat ze kunnen worden toegepast op de andere kanalen. Klik op OK. Selecteer de locatie om het transformatiebestand op te slaan (standaard ingesteld op de invoermap) en klik op Openen. Selecteer de DAPI-afbeelding die als referentie voor de transformaties moet dienen. Het DAPI-beeld van elk van de andere rondes wordt hierop uitgelijnd.OPMERKING: Als ze klaar zijn, verschijnen de geregistreerde afbeeldingen als een stapel (en in de uitvoermap). Gebruik de schuifbalk aan de onderkant om heen en weer te bladeren tussen de afbeeldingen om te controleren of de beeldregistratie succesvol was (de kernen bevinden zich op dezelfde plaats in beide afbeeldingen, althans voor de overlappende gebieden). Controleer of er een .xml bestand is gemaakt voor elke ronde van de invoerafbeeldingen.OPMERKING: Deze bevatten de vertaalparameters die nodig zijn voor de bestanden uit die ronde. Maak een map met alle te registreren afbeeldingen (elk kanaal van elke ronde). Let op de volgorde van de bestanden. Maak een map voor de transformatieparameters, en maak voor elke ronde één kopie van het .xml bestand per te registreren kanaal. Controleer nogmaals of de bestandsvolgorde (op naam) hetzelfde is tussen de te registreren afbeeldingen en de kopieën van de transformatieparameters, aangezien de volgende stap elke afbeelding doorloopt en transformeert in de volgorde van de transformatieparameterbestanden. Klik op Plug-ins | Transformeren | Transformeer Virtual Stack Slices. Selecteer onder Bronmap de map met de afbeeldingen die u wilt registreren. Selecteer onder Uitvoermap de map die is gemaakt voor de registratieuitvoer. Selecteer in de map Transformaties de map met de .xml bestanden met één kopie per afbeeldingsbestand dat moet worden getransformeerd. Nogmaals, zorg ervoor dat de volgorde overeenkomt met de bestanden (d.w.z. één kopie van de ronde 1 .xml voor elk ronde 1 kanaal, één kopie van de ronde 2 .xml voor elk ronde 2 kanaal, enz.). Klik op OK.OPMERKING: Als ze klaar zijn, verschijnen de geregistreerde afbeeldingen van die ronde als een stapel (en in de uitvoermap). Gebruik de schuifbalk aan de onderkant om heen en weer te schakelen tussen de kanalen. Controleer of alle kanalen op dezelfde manier zijn getransformeerd. Als dit niet het geval is, is dit waarschijnlijk te wijten aan een verkeerd .xml-bestand in de map transformaties; Repareer in dit geval het bestand en herhaal.OPMERKING: Het weergegeven helderheidsbereik is gebaseerd op één kanaal, maar dit heeft geen invloed op de daadwerkelijk opgeslagen beelden, alleen op de weergave. Merk op dat de geregistreerde beelden allemaal met succes zijn uitgelijnd over de rondes en klaar zijn voor overlays/downstream-analyse.OPMERKING: Er zijn efficiëntere programmatische manieren om de registratie voor grote batches uit te voeren. De hier gepresenteerde methode is slechts een eenvoudige methode waarvoor geen programmering nodig is.

Representative Results

Als validatie van de cerebrale organoïde-identiteit werden histologische secties van een volwassen (2 maanden oude) cerebrale organoïde gekleurd voor PAX6 (een marker van dorsale NPC’s23) en SATB2 (een marker van volwassen, postmitotische, bovenste laag neuronen24). Zoals verwacht waren PAX6+- cellen aanwezig aan de binnenkant van de organoïde en SATB2+- cellen in de bovenste lagen (Figuur 2). Deze resultaten ondersteunen dat de gebruikte cerebrale organoïden inderdaad dorsale voorhersenen waren, zoals gespecificeerd in de differentiatiekit. Om de dosisafhankelijkheid van het cerebrale organoïdetransplantatiesysteem vast te stellen, werden 2 maanden oude cerebrale organoïden geïnjecteerd met een toenemend aantal EGFP+ iPSC-afgeleide NPC’s. Er was een duidelijke dosisafhankelijkheid van GFP-fluorescentie van het aantal ingangscellen, met consistente EGFP+ -celpatchdetectie bij 10.000 cellen en hoger (Figuur 3). De persistentie en migratie van de getransplanteerde NPC’s werden vervolgens beoordeeld door de getransplanteerde organoïden in de loop van de tijd te volgen. Hiervoor werden 50.000 iPSC-afgeleide EGFP+ NPC’s getransplanteerd in 2-3 maanden oude cerebrale organoïden gegenereerd uit dezelfde iPSC-lijn. De geïnjecteerde organoïden en controles werden in de komende 3-4 maanden op aangegeven tijdstippen in beeld gebracht op EGFP-positiviteit. In deze transplantatiereeks hebben we persistentie van de geïnjecteerde plaats waargenomen gedurende de trackingperiode van 4 maanden (Figuur 4A). Aanvullende EGFP+ -celpleisters verschenen 9 dagen na transplantatie en hielden aan tot het eindpunt van de studie (3-4 maanden, afhankelijk van de organoïde), wat wijst op de migratie van de cellen en integratie op hun nieuwe locaties (Figuur 4A). Bij een hogere vergroting was een duidelijke neurale morfologie waarneembaar met lange projecties in de organoïde (Figuur 4B), wat de integratie van de geïnjecteerde cellen bevestigde. Om de differentiatiestatus van de geïnjecteerde cellen laat na injectie te bepalen, werden de 4 maanden gevolgde organoïde en de controle ervan gefixeerd, met paraffine ingebed, in plakjes van 15 μm dik gesneden en op glasplaatjes gemonteerd. De plakjes werden vervolgens verwerkt en gekleurd in een enkele ronde fluorescerende kleuring (EGFP, TUJ1, NESTIN) of gedurende twee opeenvolgende kleuringscycli om extra markers toe te voegen (MAP2, GFAP). De eerste enkelvoudige kleuring bevestigde de aanwezigheid van EGFP+-cellen op de injectieplaats, waaronder een mengsel van cellen die de NPC-status behielden (NESTIN+TUJ1−) en cellen die zich hadden gedifferentieerd in de richting van een neuraal lot (NESTIN−TUJ1+) (Figuur 5). Voor zowel de controle- als de geïnjecteerde organoïden werden zeer weinig NESTIN+ NPC’s waargenomen (de meeste, maar niet alle EGFP+ getransplanteerde NPC’s op de injectieplaats), met een meerderheid van TUJ1+ onvolgroeide-rijpe neuronen (Figuur 5). De tweeronde kleuring gaf meer details en onthulde rijpe neuronen (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) rond het grootste deel van het buitenste gebied van de organoïde, met gebieden met onrijpe (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) neuronen in het midden (Figuur 6A,B). Astrocyten (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) waren aanwezig in zowel de geïnjecteerde als de controleorganoïden en werden afgewisseld langs de buitenranden (Figuur 6A,B). De plak waarvoor de tweeronde kleuring in de geïnjecteerde organoïde werd uitgevoerd, toonde een kleine satellietkolonie van EGFP+-cellen ver van de injectieplaats die het fenotype van volwassen neuronen had aangenomen (Figuur 6B,C). Sommige hiervan leken zich in de nabijheid van astrocyten te bevinden; er waren echter geen EGFP+-cellen met volledige overlap met de GFAP-kleuring, wat suggereert dat ze naast elkaar lagen in plaats van de astrocyten zelf te genereren (Figuur 6B,C). Figuur 1: Transplantatiemodel van gelabelde cellen in cerebrale organoïden. Schematisch overzicht van het genereren van gelabelde cellen door lentivirale transductie, hun transplantatie in cerebrale organoïden en tracking door middel van beeldvorming van levende cellen en immunofluorescentie. Afkorting: GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Immunofluorescentie van histologische doorsneden die de architectuur van vroege en late organoïden laten zien. Een cerebrale organoïde van 2 maanden oud werd gefixeerd, met paraffine ingebed, in plakjes gesneden en gekleurd met PAX6, SATB2 en DAPI. Een ongekleurde doorsnede werd gebruikt om de belichtings- en integratietijd in te stellen om een vals-positief signaal van autofluorescentie te voorkomen. PAX6+-cellen waren aanwezig aan de binnenkant van de organoïde, terwijl SATB2+-cellen aanwezig waren in de bovenste lagen. Z-stack-beelden werden om de 4,2 μm genomen door het hele weefselgedeelte van 15 μm. Optische secties werden gecombineerd met behulp van de focus stacking-optie in de Gen5-software met standaardopties. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: PAX6 = gepaarde box 6 proteïne; SATB2 = speciaal AT-rijk sequentiebindend eiwit 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Dosisafhankelijke implantatie van NPC’s in cerebrale organoïden. De organoïden werden getransplanteerd met 0 (negatieve controle), 1.000, 5.000, 10.000 of 50.000 GFP+ iPSC-afgeleide NPC’s. 1 week na de transplantatie werden de organoïden afgebeeld op een Cytation 5 met een GFP-filterkubus. De negatieve controle werd gebruikt om de belichtings- en integratietijd in te stellen om autofluorescentie te minimaliseren. Donkere kleuren duiden op meer EGFP-fluorescentie ten opzichte van de negatieve controle. Schaalbalken = 100 μm. Dit zijn 4x afbeeldingen van de hele organoïden. Na beeldvorming werd voorafgaand aan de weergave een rollende bal achtergrondaftrekking uitgevoerd met een pixelstraal van 50 om te corrigeren voor de variabele achtergrondintensiteit over de organoïden. Injectieplaatsen die zijn geïdentificeerd als de regio’s met de hoogste implantatie, worden aangegeven met een rode pijl waar implantatie aanwezig was. Afkortingen: NPC’s = neurale voorlopercellen; GFP = groen fluorescerend eiwit; EGFP = verbeterd GFP; iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Volgen van getransplanteerde celgroei, migratie en persistentie met fluorescentie live-cell beeldvorming. (A) Controle- en getransplanteerde (50.000 GFP+ iPSC-afgeleide NPC’s) organoïden werden gevolgd door fluorescentie live-cell beeldvorming in de loop van 2-4 maanden uit twee onafhankelijke transplantatiesets. Negatieve controleorganoïden werden gebruikt om de belichtings- en integratietijd in te stellen om de autofluorescentie op elk tijdstip te minimaliseren. EGFP-beelden werden vastgelegd met behulp van een GFP-filterkubus op de Cytation 5 op aangegeven tijdstippen na transplantatie. Donkere kleuren duiden op meer EGFP-fluorescentie ten opzichte van de negatieve controle voor dat tijdstip. Voorafgaand aan de weergave werd een rollende bal achtergrondaftrekking uitgevoerd met een pixelstraal van 50 om te corrigeren voor de variabele achtergrondintensiteit over de organoïden. De organoïden werden op elk tijdstip in ongeveer dezelfde richting geplaatst en de afbeeldingen werden gedraaid voor consistentie van de weergave en om de getransplanteerde celgroei duidelijk te laten zien. De injectieplaatsen die zijn geïdentificeerd als de regio’s met de hoogste implantatie op het vroegste tijdstip, zijn aangegeven met een rode pijl. Een voorbeeld van een negatieve controle-organoïde is onderaan de figuur weergegeven. (B) Voorbeeld 20x afbeeldingen worden getoond van geënte organoïden in week 1 en week 15 na transplantatie. Het lokale contrast werd voorafgaand aan de weergave verbeterd met behulp van FIJI om de zichtbaarheid van neurieten te garanderen. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: NPC’s = neurale voorlopercellen; GFP = groen fluorescerend eiwit; EGFP = verbeterd GFP; iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Immunofluorescentie van de histologische secties die de persistentie van de getransplanteerde NPC’s op de injectieplaats aantonen, samen met migratie en neurale differentiatie. Eenkanaals fluorescentiebeelden van (A) niet-geïnjecteerde en (B) getransplanteerde organoïden. De overlay-afbeelding aan de rechterkant toont de drie interessekanalen (NESTIN, TUJ1 en EGFP), maar bevat geen DAPI. De displayminima zijn zo ingesteld dat alleen het signaal van de negatieve cellen wordt uitgesloten (bepaald voor EGFP van de niet-geïnjecteerde controle en voor andere kanalen op basis van bekende markercombinaties). De displaymaxima waren gebaseerd op het hoogste signaal dat voor dat antilichaam in een cel werd waargenomen. Het weergavebereik werd constant gehouden tussen de niet-geïnjecteerde en getransplanteerde organoïden om een directe vergelijking mogelijk te maken. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: NPC’s = neurale voorlopercellen; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylinderol; TUJ1 = bèta-III tubuline; EGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Beoordeling van de differentiatietoestand en lokalisatie van getransplanteerde cellen met behulp van cyclische immunofluorescentie van de histologische secties. Eenkanaals fluorescentiebeelden van de niet-geïnjecteerde, (A) leeftijdsgebonden en (B) getransplanteerde organoïden worden getoond voor de eerste en tweede kleuringsronde zoals aangegeven. De displayminima zijn zo ingesteld dat alleen het signaal van de negatieve cellen wordt uitgesloten (bepaald voor EGFP van de niet-geïnjecteerde controle en voor andere kanalen op basis van bekende markercombinaties). De displaymaxima waren gebaseerd op het hoogste signaal dat voor dat antilichaam in een cel werd waargenomen. Het weergavebereik (en natuurlijk de beeldvormingsparameters) werd constant gehouden tussen de controle- en geïnjecteerde organoïden om een directe vergelijking mogelijk te maken. Schaalbalken = 100 μm. Aan de rechterkant wordt voor elke kleuringsronde voor elke organoïde een overlay-afbeelding (exclusief DAPI) getoond. (B) Voor de geïnjecteerde organoïde waarvoor beeldregistratie is uitgevoerd, worden alle beelden bijgesneden tot het gebied dat in beide kleuringsrondes is waargenomen. (B,C) Voor de geïnjecteerde organoïde zijn de EGFP+-celregio’s blauw omlijnd. Een diagram van hoe DAPI wordt gebruikt om de kenmerken tijdens de beeldregistratie te matchen, wordt weergegeven in (C), gevolgd door een algehele samenvoeging van het geregistreerde beeld. Afkortingen: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; TUJ1 = bèta-III tubuline; EGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; MAP2 = microtubuli-geassocieerd eiwit 2; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Kloon Fluorofoor Concentratie Anti-NESTIN 10C2 AlexaFluor 594 1 op 2.000 Anti-TUBB3 TUJ1 AlexaFluor 647 1 op 2.000 Anti-GFP FM264G AlexaFluor 488 1 op 200 Anti-GFAP SMI 25 AlexaFluor 594 1 op 500 Anti-MAP2 SMI 52 AlexaFluor 488 1 op 1.000 Anti-PAX6 O18-1330 AlexaFluor 647 1 op 100 Anti-SATB2 EPNCIR130A AlexaFluor 594 1 op 500 Tabel 1: Antilichaamconcentraties voor kleuring. Afkortingen: TUBB3 = bèta-tubuline III; GFP = groen fluorescerend eiwit; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit; MAP2 = microtubuli-geassocieerd eiwit 2; PAX6 = gepaarde box 6 proteïne; SATB2 = speciaal AT-rijk sequentiebindend eiwit 2.

Discussion

Gezien de grote belangstelling voor celtherapeutische benaderingen voor de behandeling van CZS-letsels/neurodegeneratieve aandoeningen 1,2,3,4,5,6,7,8, worden modellen van celfunctie in een transplantatieomgeving steeds belangrijker. Dit artikel presenteert een methode voor de transplantatie van gelabelde, menselijke NPC’s in menselijke cerebrale organoïden, samen met hun levende celtracking en eindpuntbeoordeling door histologie en immunofluorescerende kleuring. Belangrijk is dat we aantoonden dat de getransplanteerde cellen in staat waren tot migratie, differentiatie en langdurige (4 maanden) persistentie in de organoïde-setting. Een dergelijke persistentie op lange termijn is een duidelijke toename ten opzichte van de onderhoudbaarheid van hersenplakculturen17. Dit systeem is dus geschikt voor het onderzoeken van veel van de gedragingen die men zou moeten beoordelen in een potentiële therapeutische setting, zoals overleving, proliferatie en differentiatie. Inderdaad, een orthogonale studie heeft onlangs aangetoond dat getransplanteerde NPC’s zich op dezelfde manier gedroegen in cerebrale organoïden in vergelijking met NPC’s die in NSG-muizenhersenen waren getransplanteerd20, wat het nut van organoïden als ontvanger van transplantaties bevestigt. Omdat dit een in vitro systeem is, is het ook eenvoudig om cytokines of interessante geneesmiddelen toe te voegen. Dit kan worden gebruikt om de effecten van specifieke omgevingen zoals ontstekingen en immunosuppressiva op de getransplanteerde cellen beter te begrijpen om verder na te bootsen wat ze in een therapeutische setting kunnen tegenkomen. Het cyclische immunofluorescentieprotocol dat we hebben gedemonstreerd (gebaseerd op eerder onderzoek21) breidt de kracht van deze aanpak verder uit, waardoor een breed scala aan afstammings- en mogelijk ziektespecifieke markers tegelijkertijd in een enkele sectie kan worden beoordeeld, en waardoor een nauwkeurige tracking van de getransplanteerde cellen en hun impact op het weefsel mogelijk wordt. Natuurlijk kunnen in plaats daarvan andere methoden voor eindpuntbeoordeling worden gebruikt, afhankelijk van de doelen van de analyse. Weefselopruiming met 3D-reconstructie kan bijvoorbeeld worden gebruikt als celmorfologie van primair belang is, of dissociatie gevolgd door flowcytometrie kan worden gebruikt als de kwantificering van specifieke celtypen het einddoel is. We verwachten dat deze methode gemakkelijk uitbreidbaar zal zijn naar andere celtypen zoals CZS-tumoren, waardoor hun studie mogelijk is in een micro-ecologisch relevante context. Evenzo zouden de organoïden die als ontvangers worden gebruikt, kunnen worden uitgewisseld voor ziektemodelorganoïden 25,26,27, waardoor mogelijk transplantatiebenaderingen voor deze aandoeningen kunnen worden gemodelleerd.

Zoals bij alle modellen, heeft ook het hier gepresenteerde model zijn eigen beperkingen. Ten eerste zijn iPSC-afgeleide organoïden onrijp in hun ontwikkeling19 en hebben ze dus belangrijke verschillen met de ouder wordende hersenen, waarin veel neurodegeneratieve ziekten zich manifesteren. Cerebrale organoïden zijn ook niet-uniform in ontwikkeling19, waardoor consistente injectie in exact dezelfde fysiologische niche wordt uitgesloten. Bovendien, hoewel ze de celtypen van de relevante hersengebieden bevatten 18,19, missen ze de endotheel-, microgliale en immuuncomponenten, die ook belangrijk zijn in de in vivo setting14. Dit beperkt de studie van hoe de gastheer zal reageren op de celtransplantatie. Er komen momenteel technieken online om vasculaire28– en microgliale29-cellen toe te voegen, en om de organoïdeconsistentie en regionalisatie18 te vergroten, waardoor de modelleringskracht van het organoïdetransplantatiesysteem wordt verbeterd. Ze zouden echter verder moeten worden getest en geoptimaliseerd dan wat hier wordt gepresenteerd. Hoewel dit protocol goedkoop is en geen gespecialiseerde apparatuur vereist, blijven er een aantal belangrijke technische overwegingen, bijvoorbeeld de injectiediepte. Dit is zowel te wijten aan het feit dat organoïden niet worden doorbloed en dus vaak een necrotisch centrum hebben als ze te groot worden19 en dat licht niet door de organoïdekern kan dringen voor het volgen van levende cellen. Zo kunnen de cellen die te diep zijn geïnjecteerd en kolonies die naar binnen zijn gemigreerd, worden gemist. Hoewel dit kan worden verbeterd door het gebruik van fluoroforen met een langere golflengte en een betere weefselpenetrantie30, zal dit, afhankelijk van de grootte van de organoïde en het detectieapparaat, waarschijnlijk een overweging blijven. Ten slotte, aangezien hersenorganoïden zich in een staat van ontwikkeling bevinden, is de timing van de transplantatie een andere belangrijke overweging, aangezien de omgeving waarschijnlijk zal verschillen afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van de organoïde waarin deze wordt geïnjecteerd. Hoewel dit tot op zekere hoogte kan worden gecontroleerd door te zorgen voor een consistente leeftijd van de organoïden op het moment van injectie, is het zonder twijfel een factor waarmee rekening moet worden gehouden.

Dit protocol is goedkoop, eenvoudig, dierproefvrij en vereist geen gespecialiseerde apparatuur, waardoor transplantatiemodellering toegankelijk is voor een grotere verscheidenheid aan laboratoria. Met het snelle tempo van vooruitgang, zowel in neurale celtherapieën als organoïdemodelsystemen, verwachten we dat het hier gepresenteerde organoïdetransplantatieprotocol een bruikbaar model zal zijn voor een reeks ziekten en therapeutische benaderingen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Fondsen voor dit werk werden verstrekt via de IRIC Philanthropic fondsen van de Marcelle en Jean Coutu stichting en van het Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS #295647). D.J.H.F.K. krijgt salarisondersteuning van FRQS in de vorm van een Chercheurs-boursiers Junior 1 fellowship (#283502). M.I.I.R. werd ondersteund door een IRIC Doctoral Award van het Institut of Research in Immunology and Cancer, een Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat van de Universiteit van Montreal en de Bourse de Mérite aux cycles supérieurs.

Materials

Accutase StemCell Technologies 7920 proteolytic-collagenolytic enzyme mix
Alexa Fluor 488 anti-GFP Antibody BioLegend 338008
Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52) BioLegend 801804
Alexa Fluor 594 anti-GFAP Antibody (clone SMI 25) BioLegend 837510
Alexa Fluor 594 anti-Nestin (clone 10C2) BioLegend 656804
Alexa Fluor 647 anti-Tubulin β 3 (TUBB3) (clone TUJ1) BioLegend 801209
Citric Acid Monohydrate Fisher Chemical A104-500
Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader Biotek –
Denaturated Ethyl Alcohol (Anhydrous) ChapTec –
DMEM F12/Glutamax Thermo 10565018
Dymethil Sulfoxide (DMSO), Sterile BioShop DMS666.100
FIJI 1.53c – –
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Gen5  – –
HistoCore Arcadia H Leica Biosystems –
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Corning 356231 Phenol Red-free, LDEV-free
MX35 microtome blade  Epredia  3053835
NaOH Sigma 655104
PBS (-Ca -Mg) Sigma D8537
Puromycin Dihydrochloride Thermo A1113803
ROCK inhibitor Y-27632 Abcam ab120129
Simport Scientific Stainless-Steel Base Molds Fisher Scientific 22-038-209
Simport Scientific UNISETTE Biopsy Processing/Embedding Cassette Fisher Scientific 36-101-9255
STEMdiff Forebrain Neuron Differentiation Kit StemCell Technologies 8600
STEMdiff Neural Progenitor Medium StemCell Technologies 5833
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit StemCell Technologies 8581
Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome Thermo Scientific –
Tissue Prep Fisher Scientific T555
Tissue-Tek VIP 6  AI Tissue Processor Sakura Finetek –
Toluene (histological) ChapTec –
Trypan blue; 0.4% (wt/vol) Thermo 15250061
Tween 20 BioShop TWN510.100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spurlock, M. S., et al. Amelioration of penetrating ballistic-like brain injury induced cognitive deficits after neuronal differentiation of transplanted human neural stem cells. Journal of Neurotrauma. 34 (11), 1981 (2017).
  2. Zhou, Y., Shao, A., Xu, W., Wu, H., Deng, Y. Advance of stem cell treatment for traumatic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 301 (2019).
  3. Hayashi, Y., Lin, H. -. T., Lee, C. -. C., Tsai, K. -. J. Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer’s disease models. Journal of Biomedical Science. 27 (1), 29 (2020).
  4. Kefalopoulou, Z., et al. Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease: Two case reports. JAMA Neurology. 71 (1), 83-87 (2014).
  5. Li, W., et al. Extensive graft-derived dopaminergic innervation is maintained 24 years after transplantation in the degenerating parkinsonian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (23), 6544-6549 (2016).
  6. Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).
  7. Takahashi, J. iPS cell-based therapy for Parkinson’s disease: A Kyoto trial. Regenerative Therapy. 13, 18-22 (2020).
  8. Krause, M., Phan, T. G., Ma, H., Sobey, C. G., Lim, R. Cell-based therapies for stroke: Are we there yet. Frontiers in Neurology. 10, 656 (2019).
  9. Coles-Takabe, B. L. K., et al. Don’t look: Growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
  10. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  11. Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 136-144 (2004).
  12. Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  13. Li, J., et al. Conservation and divergence of vulnerability and responses to stressors between human and mouse astrocytes. Nature Communications. 12 (1), 3958 (2021).
  14. Morizane, A., et al. MHC matching improves engraftment of iPSC-derived neurons in non-human primates. Nature Communications. 8 (1), 385 (2017).
  15. Khrameeva, E., et al. Single-cell-resolution transcriptome map of human, chimpanzee, bonobo, and macaque brains. Genome Research. 30 (5), 776-789 (2020).
  16. Powell, K. Hybrid brains: The ethics of transplanting human neurons into animals. Nature. 608 (7921), 22-25 (2022).
  17. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  18. Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
  19. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  20. García-Delgado, A. B., et al. Brain organoids to evaluate cellular therapies. Animals. 12 (22), (2022).
  21. Lin, J. -. R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method. Nature Communications. 6 (1), 8390 (2015).
  22. Knapp, D. J. H. F., et al. Single-cell analysis identifies a CD33+ subset of human cord blood cells with high regenerative potential. Nature Cell Biology. 20 (6), 710-720 (2018).
  23. Georgala, P. A., Carr, C. B., Price, D. J. The role of Pax6 in forebrain development. Developmental Neurobiology. 71 (8), 690-709 (2011).
  24. Britanova, O., et al. Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex. Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).
  25. Kim, H., et al. Modeling G2019S-LRRK2 sporadic Parkinson’s disease in 3D midbrain organoids. Stem Cell Reports. 12 (3), 518-531 (2019).
  26. Smits, L. M., et al. Modeling Parkinson’s disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinson’s Disease. 5, 5 (2019).
  27. Jin, M., et al. Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer’s disease. Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).
  28. Sun, X. -. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 11, e76707 (2022).
  29. Popova, G., et al. Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids. Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).
  30. Wang, S., Li, B., Zhang, F. Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging. ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).

Tags

Cerebral OrganoidNeural Cell TransplantationIPSC-derived Neural Progenitor CellsEGFP Labeled CellsCell EngraftmentIn Vitro AssessmentHuman OriginDrug TestingCell TherapyCell SuspensionBasement Membrane MatrixCell InjectionOrganoid CultureMedium Change

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ibanez-Rios, M. I., Narlis, M., Hammond, C. A., Knapp, D. J. H. F. A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (197), e64770, doi:10.3791/64770 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image