מודל אורגנואיד מוחי אנושי להשתלת תאים עצביים

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה. 1. תיוג פלואורופור של תאים על ידי התמרה lentiviral הפשירו אליקוט של מטריצת קרום המרתף המסיסה, לפי בחירתכם, על קרח. בזמן שהאליקוט מפשיר, מוסיפים מים סטריליים כדי למלא את הרווחים בין הבארות בצלחת של 24 בארות, יחד עם כל הבארות החיצוניות.הערה: זה משאיר שמונה בארות פתוחות באמצע לשימוש ומבטיח שהתאים יישארו בלחות גבוהה, ובכך ממזער את השונות הנגרמת על ידי אידוי. לדלל את מטריצת קרום המרתף המסיס 1:100 בתווך DMEM/F12 קר כקרח (ריכוז סופי של 0.089 מ”ג/מ”ל התקבל עם המגרש המשמש כאן). הוסף 300 μL של מטריצת קרום מרתף מדולל מסיס לאחת הבארות האמצעיות (הפתוחות) של צלחת 24 בארות מוכן לכל זיהום להתבצע. הקפידו לכסות באופן שווה את כל תחתית הבאר, והוסיפו עוד, במידת הצורך, כדי להבטיח ציפוי אחיד. דוגרים על הצלחת במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C כדי לאפשר לשכבה להתמצק לאורך קרקעית הבאר. ודא בסוף הדגירה כי הנוזל עדיין מכסה במלואו את קרקעית הבאר ולא התאדה במרכז. אידוי הוא סימן לכך שהלחות נמוכה מדי; במקרה כזה, חזרו על הציפוי.הערה: ניתן לצפות את הלוחות בערב הקודם ולהשאיר אותם במטריצת קרום מרתף מדוללת ומסיסה ללא תופעות לוואי ניכרות; עם זאת, הסיכון של אידוי גדל מאוד, ולכן הם חייבים להיבדק בקפידה לפני השימוש. הסר את התווך מבאר אחת של NPCs שמקורם ב- iPSC הגדלים בצלחת באר.הערה: במאמר זה נעשה שימוש באבות עצביים שמקורם ב-iPSC שיוצרו באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן בין מעבר 3 למעבר 10. הוסיפו בעדינות 1 מ”ל PBS לצד הבאר, ונענעו את הצלחת כדי להבטיח שטיפה אחידה. הסר את PBS, והחלף עם 300 μL של תערובת אנזימים proteolytic-collagenolytic, שוב נדנד את הצלחת כדי להבטיח ציפוי מלא של קרקעית הבאר. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C. ודא שהתאים מתנתקים מפני השטח של הצלחת באמצעות מיקרוסקופ אור. עם פיפטה P1,000, הוסף 700 μL של DMEM/F12, ונתק את התאים על ידי ריסוס תערובת זו על כל המשטחים של תחתית הצלחת. פיפטה למעלה ולמטה כדי להבטיח שאגרגטי התאים מפורקים לתרחיף אחיד של תא יחיד. קח את התאים, ולהוסיף 9 מ”ל של מדיום DMEM/F12 בצינור חרוטי 15 מ”ל. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות. במהלך תקופה זו, להכין מספיק בינוני בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 עבור 500 μL לכל באר להיות מצופה, בתוספת 1 מ”ל עבור השעיה.הערה: Y-27632 נחוץ כדי להבטיח הישרדות גבוהה של NPCs לאחר המעבר כתאים בודדים. הסר את supernatant, ו resuspend את התאים ב 1 מ”ל של תווך תוספת Y-27632, pipeting למעלה ולמטה בעדינות מספר פעמים כדי לשבור את צברי התא. הוציאו כמה מיקרוליטרים של תאים, ודללו אותם (1:5 עד 1:10) בכחול טריפאן. לספור את התאים קיימא (טריפאן כחול-שלילי) על המוציטומטר. התאימו את הדילול הכחול של טריפאן כדי לקבל לפחות 50 תאים בני קיימא לכל רביע של ההמוציטומטר כדי להבטיח שהספירה מדויקת. חשב את נפח תרחיף התאים הדרוש כדי ש-100,000 תאים יהיו נוכחים בכל באר. מערבבים את התאים בעדינות למעלה ולמטה על ידי פיפט, ותופסים את הנפח המחושב (עבור 100,000 תאים לבאר). הוסף זאת למדיום בתוספת Y-27632 (משלב 1.11) כך שהנפח הסופי הוא 500 μL לכל באר שיש לצפות. הסר את מטריצת קרום המרתף המדוללת והמסיסה מהבארות שצופו קודם לכן (בהנחה שהדגירה של 30 דקות או יותר הושלמה). מערבבים את התאים בעדינות על ידי פיפטינג, ומוסיפים 500 μL של תרחיף התא לכל באר. כדי לפזר את התאים באופן שווה, הזיזו את הצלחת בתנועת סימן “+” גדולה עם טאטוא ליניארי עדין (קדימה-אחורה, עצירה, אחורה-קדימה) מיד לפני הכניסה לאינקובטור תרבית תאים. יש לדגור למשך הלילה (16-24 שעות) בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. הסר את המדיום, ולהוסיף את lentivirus titrated. אם נדרשים אירועי אינטגרציה בודדים, יש לשאוף לריבוי זיהומים של 0.3 יחידות זיהומיות לכל תא (רצוי לטיטרציה על התאים המעניינים), ולהגיע עד 500 μL בתווך (ללא Y-27632).הערה: את lentivirus של עניין ניתן לרכוש מראש titrated או מיוצר בבית כפי שנעשה בעבר22. כאן, GFP lentivirus המיוצר בתוך הבית עם עמידות puromycin שימש כדי ליצור ולבחור NPCs המבטאים EGFP. אם הלנטיוירוס לא עבר טיטרציה על התאים המעניינים ומספר העותק הוא קריטי, מומלץ להוסיף מספר כרכים לכמה בארות ולהשתמש בבאר עם ~30% תאי EGFP+ 48-72 שעות מאוחר יותר. אם מספר העותק אינו קריטי, ניתן להוסיף עודף וירוס עם אזהרה כי מוטגנזה החדרה עלולה לגרום להתנהגות חריגה בחלק מהשיבוטים. זהירות: וקטורים לנטי-ויראליים הם סיכון ביולוגי ברמה 2-3 (תלוי בתכולתם). פעל בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות לטיפול בלנטיוירוס, טיהור משטחים וכלי פלסטיק ופסולת נוזלית. להחזיר את התאים לאינקובטור, ולדגור אותם במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2. מוציאים את התאים מהאינקובטור, ומוציאים את הסופרנטנט.זהירות: מכיוון שהסופרנאטנט מהתאים עדיין מכיל חלקיקים לנטי-ויראליים בשלב זה, המשך לעקוב אחר תקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות לטיפול בו וסילוקו. לשטוף את התאים עם 2 x 500 μL של PBS על ידי הוספה עדינה PBS לקיר של הבאר; לאחר מכן, הסר מפינת הבאר כדי לשטוף את כל lentivirus שנותרו.זהירות: מכיוון שהסופרנאטנט מהתאים עדיין מכיל חלקיקים לנטי-ויראליים בשלב זה, המשך לעקוב אחר תקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות לטיפול בו וסילוקו. החליפו ל-500 מיקרוליטר של מדיום טרי (ללא Y-27632), והמשיכו לגדול ב-37°C וב-5% CO2 בן לילה. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים כדי לאמת את שיעור התאים המבטאים EGFP ולבחור את הבאר שאיתה יש להמשיך. אם וקטור הבחירה הלנטיויראלי מכיל קלטת בחירה (גן עמידות לאנטיביוטיקה כגון עמידות לפורומיצין), הוסף את סוכן הבחירה (כאן, 1 מיקרוגרם/מ”ל פורומיצין) למדיום במינון שאומת בעבר והורג תאים רגישים אך לא עמידים. אחרת, השתמש במיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות כדי לבודד את תאי EGFP+ בזמן הפיצול הראשון. מעתה ואילך, לשמור על התאים עם ניטור יומי עבור confluency, ולבצע שינויים בינוניים מלאים מדי יום. כאשר מגיעים למפגש, הכינו באר אחת או יותר של צלחת טרייה מצופה 6 בארות (עם 1 מ”ל של מטריצת קרום מרתף מדוללת ומסיסה; ראו שלבים 1.3-1.5), וקצרו את התאים כמתואר בשלבים 1.6-1.15.הערה: אם לא כלול סוכן בחירה, מיין את התאים לפי ציטומטריית זרימה בשלב זה. ודא כי התאים ממוינים עם זרבובית רחבה מספיק ולחץ נמוך כדי למזער מתח, כמו גם כי 10 מיקרומטר Y-27632 כלול בכל שלב בתהליך המיון. לוחית את התאים לצפיפות סופית של 200,000 תאים לסמ”ק2. לשמור על ניטור יומי ולהשלים שינויים בינוניים מדי יום.הערה: כאשר התאים מגיעים שוב למפגש, הם מוכנים כעת לשימוש. לחלופין, כעת ניתן להקפיא מלאי לשימוש עתידי כדלקמן. פצל, קצור וספור את התאים כמתואר בשלבים 1.6-1.15. תייגו מראש קבוצה של קריובלים עם המידע הרלוונטי (למשל, מעבר, EGFP%, קו). השהיה מחדש ב-400,000 תאים/מ”ל ב-DMSO בינוני + 10%.הערה: DMSO רעיל לתאים כאשר אינו קפוא, לכן יש למזער את הזמן המושקע בטמפרטורת החדר בנוכחות DMSO. הוסיפו 1 מ”ל (400,000 תאים) של התערובת משלב 1.33 לכל קריוביאלי, והניחו במיכל להקפאת תאים. מעבירים את המיכל למקפיא בטמפרטורה של 80°C למשך הלילה. למחרת, להעביר את התאים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. 2. הזרקת תאים מסומנים לאורגנואיד המוח הערה: עבור נייר זה, אורגנואידים מוחיים יוצרו באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. זה יכול להיות מוחלף עם אורגנואיד מוחי של עניין. החומרים המשמשים בחלק זה של הפרוטוקול חייבים להיות מקוררים מראש כדי למנוע את הג’לינג של מטריצת קרום המרתף המסיס מעל 4 ° C. הניחו את מזרקי האינסולין, הקצוות והצינורות שיהיו במגע עם מטריצת קרום המרתף המסיס בטמפרטורה של -20°C כדי לאפשר להם להתקרר. הפשירו אליקוט בגודל מתאים של מטריצת קרום מרתף מסיס על קרח בהתאם למספר הזריקות שיבוצעו (~ 2 μL / הזרקה). זה לוקח בערך 30 דקות. בזמן שהאליקוט מפשיר, מפצל, קוצר וסופר את התאים כמתואר בשלבים 1.6-1.15. חשב את הנפחים הדרושים לכל הזרקה. אם אתה מבצע זריקות מרובות, מקם את נפח התאים הכולל בצינור של 1.5 מ”ל, והוסף עד 1 מ”ל של DMEM/F12.הערה: יש להשתמש בנפח המאפשר מספר זריקות נוספות כדי להסביר הפסדים/שגיאות צנרת. הניחו את התאים בקרח בזמן הכנת השלבים הבאים. לאחר ההפשרה, דללו את מטריצת קרום המרתף המסיס לריכוז סופי של 3 מ”ג/מ”ל ב-DMEM/F12 קר כקרח. קח את המתלה התא היחיד מהקרח, וסובב אותו למטה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.הערה: אם צנטריפוגה בקירור אינה זמינה, סיבוב בטמפרטורת החדר נראה בדרך כלל נסבל. הסר בעדינות את המדיום לחלוטין מבלי להפריע לכדורית התא. יש להשהות מחדש את כדורית התא על ידי צנרת עדינה במטריצת קרום המרתף המדוללת והממוססת (3 מ”ג/מ”ל) כדי לקבל נפח סופי של 2 מיקרוליטר לכל הזרקה שיש לבצע, ומיד החזירו אותה לקרח עד לשימוש.הערה: ההשעיה של התאים צריכה להתבצע לאט עם טיפים מראש כדי למנוע היווצרות של בועות ו gelling. מעבירים את המזרק(ים) המצוננים מהמקפיא בטמפרטורה של 20°C לתוך דלי קרח. שמור אותם שם עד לשימוש. מוציאים את הצלחת עם האורגנואידים במוח מהאינקובטור. השתמשו בקצה רחב כדי להעביר את האורגנואיד להזרקה לצלחת בקוטר 35 מ”מ. הסר את כל המדיום האפשרי מבלי לפגוע באורגנואיד כדי לייצב אותו ולהקל על ההזרקה.הערה: חשוב להשתמש בקצוות רחבים כדי למנוע הרס של האורגנואיד. אם הם אינם זמינים, גזרו את קצהו של קצה P1,000 רגיל עם מספריים סטריליים. הניחו את צלחת 35 מ”מ המכילה את האורגנואיד תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לעזור להנחות ולהקל על ההזרקה.הערה: אם מיקרוסקופ מנתח אינו זמין באזור סטרילי, ניתן לבצע את ההזרקה ללא אחד, אם כי עם שליטה מופחתת במקצת. חלופה נוספת היא שימוש בלולאת הגדלה או משקפיים. ברגע שהאורגנואידים מוכנים להזרקה, יש להשהות מחדש בעדינות את התאים עם קצה פיפטה P20 מקורר, ולהעביר 2 μL (המכיל את מספר התאים הרצוי להזרקה) על מגלשת זכוכית סטרילית מצוננת.הערה: עבור הזרקות מרובות, ניתן להוסיף נפחים נוספים של 2 μL על פני שקופית הזכוכית. שמור אותו על קרח, והיזהר למנוע אידוי. קח מזרק אינסולין מראש מן הקרח, ולצייר לאט את 2 μL של תרחיף התא עם שיפוע של המחט פונה כלפי מטה כדי לאפשר את כל התאים / מדיום להיקלט.הערה: הקפד ללכת לאט מאוד כדי למנוע שאיבת אוויר. פתחו את מכסה התבשיל המכיל את האורגנואיד, ומקדו בו את המיקרוסקופ. החזיקו את המנה ביד אחת. מניחים את שיפוע המחט כלפי מעלה, וביד השנייה מזריקים את התאים באיטיות לתוך משטח האורגנואידים.הערה: חשוב להזריק לאט כדי למנוע פגיעה ברקמה. לאחר ההזרקה, מחזירים את המכסה לצלחת, ומניחים לאורגנואיד המוזרק לשבת למשך 1-2 דקות.הערה: פעולה זו מאפשרת למטריצת קרום המרתף המדוללת והמסיסה לג’ל, ומחזיקה את התאים במקומם. אם מוסיפים את המדיום מוקדם מדי, הוא יכול לשטוף את התאים היושבים על פני השטח. מוסיפים בעדינות 500 μL של תווך האורגנואידים, ומעבירים את האורגנואיד עם קצה רחב לתוך באר של צלחת 24 בארות. יש לדגור על האורגנואיד בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך הלילה. בצע שינויים בינוניים מלאים כל יומיים.הערה: חשוב לכלול אורגנואיד בקרה שלילי (מוזרק דמה), אשר ישמש להתאמות הדמיה. לשם כך, הזריקו אורגנואיד כפי שתואר קודם לכן עם מטריצת קרום מרתף מדוללת ומסיסה (3 מ”ג / מ”ל) כדי לקבל נפח סופי של 2 μL ללא תאים. 3. מעקב השתל על ידי הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים הערה: השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי שיכול לעורר את הפלואורופור המעניין ויש לו את ערכת המסנן הדרושה כדי לזהות את הפלואורסצנטיות שלו. כפי שהוזכר קודם, NPCs בשימוש כאן היו EGFP+, עם שיא עירור של 488 ננומטר ושיא פליטה של ~ 510 ננומטר. טען אורגנואיד בקרה שלילי (לא מוזרק או מוזרק מדומה), והגדר את עוצמת ההארה ואת זמן החשיפה כך שהאוטופלואורסצנטיות תהיה מינימלית. עבור המכשיר המשמש כאן, עוצמת ההארה נקבעה בין 1 ל -2 וזמן החשיפה בין 80 מילישניות ל -100 מילישניות.הערה: מכיוון שאורכי גל עירור רבים (במיוחד אורכי גל נמוכים יותר) יכולים להיות רעילים לתאים, מומלץ לשמור על עוצמה נמוכה ולהימנע מלחפש זמן רב מדי כדי למנוע נזק לאורגנואיד. טען את אורגנואיד הבקרה החיובי, והגדל את זמן החשיפה במידת הצורך כדי להבטיח שהתאים המסומנים נראים בבירור. מקם מחדש את האורגנואיד עם קצה פיפטה רחב כדי למצוא את אתר ההזרקה (אזור EGFP+ ). הסר את המדיום לחלוטין מאורגנואיד הבקרה השלילי. טען את אורגנואיד הבקרה השלילי, וצלם אותו עם ההגדרות שנבחרו (עבור המכשיר המשמש כאן, עוצמת ההארה נקבעה בין 1 ל -2 וזמן החשיפה בין 80 מילישניות ל -100 אלפיות השנייה). לאחר השלמת ההדמיה, יש להוסיף מיד מדיום טרי כדי למנוע מהאורגנואיד להתייבש.הערה: הסרה בינונית היא קריטית לקבלת תמונה טובה מכיוון שהיא מקבעת את הגובה והכיוון של האורגנואידים, שאחרת צפים ונעים כל הזמן, ומונעים הדמיה באיכות גבוהה. חזור על ההסרה/הדמיה הבינונית עם כל אחד מאורגנואידי הבדיקה. החזר את האורגנואידים לשינויים נורמליים בדגירה/בינונית (כמו בשלב 2.16), וחזור על ההדמיה במרווחי הזמן הרצויים. כאן, האורגנואידים צולמו בשבוע 1, בשבוע 9 ובשבוע 16 לאחר ההזרקה כדי לעקוב ולבדוק את ההישרדות, ההתפשטות, ההתמיינות והנדידה של NPCs EGFP+ שהוזרקו. 4. היסטולוגיה ואימונופלואורסנציה בנקודת הקצה, העבר את האורגנואיד לקלטת היסטולוגיה המסומנת עם מזהה האורגנואיד ומזהים נחוצים אחרים. ממלאים את הקלטת ב-10% פורמלין וסוגרים אותה. יש לשמור אותו בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. העבר את הקלטת הסגורה עם האורגנואיד לתהליך רקמה, והגדר את הפרוטוקול הבא: אתנול 70% 10 דקות, אתנול 80% 20 דקות, אתנול 95% 30 דקות, אתנול 100% 30 דקות, אתנול 100% 30 דקות, אתנול 100% 50 דקות, טולואן 30 דקות, טולואן 40 דקות, טולואן 50 דקות, פרפין 25 דקות ב-59 מעלות צלזיוס, פרפין 35 דקות ב-59 מעלות צלזיוס, פרפין 40 דקות ב-59°C, פרפין 50 דקות ב-59°C.הערה: השלבים לעיל נעשים תחת ואקום בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. פרוטוקול זה מחליף את המים בשיפועים של אלכוהול עד 100%. שלב הביניים עם טולואן הוא מעבר בין האלכוהול לפרפין, שכן שניהם מסיסים בו. זהירות: טולואן ופרפין נחשבים לחומרים מסוכנים מכיוון שהם יכולים להיות נוזלים דליקים מאוד ויכולים לגרום נזק על ידי שאיפה או מגע עם העור או העיניים. הקפידו לאחסן אותם סגורים היטב בחלל מאובטח. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת הטיפול בהם. יש להשליך פסולת בהתאם לתקנות הסיכון הכימי המקומיות. מעבירים את הקלטת הסגורה עם האורגנואיד לאמבט פרפין בעמדת ההטבעה. מוציאים את הקלטת מהאמבטיה, פותחים אותה ומעבירים את האורגנואיד לתבנית בסיס פלדה. מניחים את התבנית מתחת למתקן הפרפין, ומכסים אותו לחלוטין בפרפין. מניחים את הקלטת הריקה על החלק העליון של תבנית בסיס הפלדה. כאן, להוסיף עוד פרפין על גבי הקלטת. מעבירים את תבנית בסיס הפלדה עם הקלטת למעלה לקרח, ומניחים לה להתקרר במשך 5 דקות. מוציאים את תבנית הפלדה, ושומרים את הקלטת עם האורגנואיד מוטבע בבלוק פרפין. מעבירים את הקלטת למיקרוטום כדי לחתוך חלקים. חתכו מקטעים לפי הצורך.הערה: כאן, חלקים בעובי 15 מיקרומטר נעשו בכל האורגנואיד. זרוק כל קטע על פני השטח של אמבט מים ב 45 מעלות צלזיוס, והרים אותו על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית. תנו למגלשות להתייבש באינקובטור בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך הלילה.הערה: כעת ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורת החדר עד למועד הצביעה. מניחים את המגלשה בצנצנת מכתימה של מגלשת קופלין מלאה בטולואן למשך 2 דקות. חזור על שלב זה פעם נוספת.זהירות: טולואן נחשב לחומר מסוכן מכיוון שהוא יכול להיות נוזל דליק מאוד ויכול לגרום נזק על ידי שאיפה או מגע עם העור או העיניים. הקפידו לאחסן אותו סגור היטב בחלל מאובטח. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת הטיפול בו. יש להשליך פסולת בהתאם לתקנות הסיכון הכימי המקומיות. מעבירים לצנצנת זכוכית קופלין מלאה ב-EtOH 100% למשך 2 דקות. חזור על שלב זה פעם נוספת. מעבירים לצנצנת זכוכית עם מגלשת קופלין מלאה במים מזוקקים למשך 2 דקות. חזור על שלב זה פעם נוספת. לשליפת אנטיגן, הכינו חיץ ציטראט (10 mM חומצת לימון, 0.05% Tween 20, pH 6.0).הערה: ניתן לאחסן מאגר ציטראט בטמפרטורת החדר עד 3 חודשים או ב-4°C לאחסון ארוך יותר. הגדר אמבט מים בין 95 °C (75 °F) ו 100 °C (75 °F).זהירות: אמבט מים זה עלול לגרום לכוויות אם לא נזהרים. נקוט בכל אמצעי הזהירות הדרושים כדי למנוע מגע ישיר עם האמבטיה או מרכיביה. באמבט המים, צפים מיכל פלסטיק שיכול להתאים למגלשות שבתוכו. ודאו שהפלסטיק אינו נוגע בתחתית האמבטיה (בהנחה שמדובר באמבטיה עם חימום תחתון) כדי למנוע התכה. יוצקים את חיץ ציטראט בתוך מיכל פלסטיק, ולתת לו להגיע 95-100 מעלות צלזיוס. ברגע שהמאגר מגיע לטמפרטורה הרצויה, הניחו את המגלשות בתוך המאגר, וכסו את המיכל באופן רופף במכסה. השאירו את המגלשות בתוך המיכל באמבט המים למשך 30-40 דקות. הסר את מיכל הפלסטיק מאמבט המים, ולתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות נוספות. שטפו את המגלשות במשך 3 x 2 דקות עם PBS. הסר את PBS עם ממחטת נייר מבלי לגעת בדגימה או לייבש אותה יתר על המידה. הכינו את חיץ החדירה (90 מ”ל של PBS + 0.1% Tween-20), ומלאו בו צנצנת מכתימה מזכוכית מגלשה. טבלו את המגלשות במאגר החדירה, ודגרו במשך 10 דקות. שטפו את המגלשות במשך 3 x 2 דקות עם PBS. הכינו מספיק תערובת כתמים כדי לכסות כל דגימה (~ 25 μL).הערה: ראה טבלה 1 עבור הנוגדנים והריכוזים הסופיים המשמשים כאן. הוסיפו 25 מיקרוליטר של תערובת כתמים כדי לכסות כל פרוסת אורגנואידים. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת או למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.הערה: ודא שהדגימות נשארות בלחות גבוהה כדי למנוע אידוי של תערובת הצביעה. אם מיכל לשמירה על לחות המגלשות אינו זמין, שים אותם בתוך קופסה עם כמה רקמות רטובות בפינה. שטפו את המגלשות במשך 3 x 2 דקות עם PBS. יש לשטוף פעם אחת במים מזוקקים בתוך צנצנת זכוכית עם הכתמה כדי להסיר את המלח. הוסף 10 μL של mountant נוזלי + 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לכל אחת מהדגימות.הערה: ניתן לאטום את השקופיות אם לא בוצע סבב צביעה שני. כאן, המגלשות לא כוסו כדי לאפשר גישה למרווה / שמירה מכיוון שהסרת החלקה עלולה לפגוע ברקמה. דמיינו את השקופיות באמצעות המיקרוסקופ הפלואורסצנטי שנבחר.הערה: יש לוודא שיש בקרות חיוביות ושליליות לכל נוגדן כדי לאפשר הגדרה נכונה של העוצמות וזמני החשיפה (עבור המכשיר המשמש כאן, עוצמת ההארה נקבעה בין 5 ל -6 וזמן החשיפה בין 2,000 מילישניות ל -3,000 מילישניות), אם כי זה יכול להשתנות בהתאם לנוגדן. בנוסף, ודא כי במיקרוסקופ יש גלאים מתאימים עבור כל ערוץ בשימוש. שימו לב שמכיוון שהדגימות אינן מכוסות, יש להניח אותן עם הפנים כלפי מעלה בזמן ההדמיה שלהן. לאחר ההדמיה, הכינו חיץ מרווה טרי 2x (9% H2O2 + 50 mM NaOH ב- PBS).הערה: יש להכין את פתרון המרווה טרי מיד לפני השימוש בו. התגובה רגישה לפעילות של H2O2, אשר תפחת עם הזמן. זהירות: H2O2 הוא מגרה, ו- NaOH הוא קאוסטי. אלה צריכים להיות מטופלים עם ציוד בטיחות מתאים, ויש להימנע ממגע בעור. יש לוודא שהם מושלכים בהתאם למדיניות הבטיחות הכימית המקומית. ממלאים את צנצנת הזכוכית של קופלין באמצע הדרך עם חיץ מרווה פי 2 (45 מ”ל), מוסיפים PBS של 45 מ”ל ומכניסים את המגלשות פנימה. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F). בדוק במיקרוסקופ פלואורסצנטי שהפלואורופורים היו מרווים ביעילות. חזור על הצביעה וההדמיה כנ”ל.הערה: ניתן לחזור על המרווה והשמירה לסבבים נוספים לפי הצורך, אם כי הסיכון לנזק עולה עם כל סבב נוסף. 5. רישום תמונה פתח את פיג’י. צור תיקייה עם תמונות DAPI מסבב 1 וסיבוב 2. שנה את השמות כדי להבהיר איזה מהם, במידת הצורך. צור תיקייה ריקה לפלט של רישום התמונה. לחץ על תוספים | הרשמה | רשום פרוסות מחסנית וירטואליות. תחת ספריית מקור, בחר את התיקיה המכילה את תמונות DAPI מכל סבב. תחת ספריית פלט, בחר את התיקיה שנוצרה עבור פלט הרישום. הגדר את מודל חילוץ התכונות לקשיח ואת התפריט הנפתח מודל רישום לקשיח – תרגם+סובב כדי לתקן את ההתאמה, ואפשר להזיז ולסובב את התמונה רק ליישור ולא לעיוות.הערה: אם צפוי עיוות, ניתן להתאים את מודל חילוץ התכונות ואת מודל הרישום ל – Affine או למודלים אחרים לפי הצורך, אם כי הדבר עלול לגרום להמרות בלתי רצויות. לעיתים עלולה להיפגע פרוסה בין הסיבובים, מה שעלול למנוע רישום מוצלח. סמן את התיבה שמור המרות כדי לשמור את פרמטרי שינוי הצורה, ולאפשר להחיל אותם על הערוצים האחרים. לחץ על אישור. בחר את המיקום לשמירת קובץ ההמרה (ברירת המחדל לספריית הקלט) ולחץ על פתח. בחר בתמונת DAPI שתשמש כהפניה להמרות. תמונת DAPI מכל אחד מהסבבים האחרים תהיה מיושרת לסבב זה.הערה: לאחר השלמתה, התמונות הרשומות יופיעו כערימה (ובתיקיית הפלט). השתמש בפס השקופיות בחלק התחתון כדי לדפדף קדימה ואחורה בין התמונות כדי לוודא שרישום התמונה הצליח (הגרעינים נמצאים באותו מקום בשתי התמונות, לפחות באזורים החופפים). ודא שנוצר קובץ .xml עבור כל סבב של תמונות הקלט.הערה: אלה מכילים את פרמטרי התרגום הדרושים לקבצים מאותו סבב. צור תיקייה המכילה את כל התמונות לרישום (כל ערוץ של כל סיבוב). שים לב לסדר הקבצים. צור תיקייה לפרמטרי ההמרה, וצור עותק אחד של קובץ .xml לכל סבב לכל ערוץ לרישום. בדוק שוב שסדר הקבצים (לפי שם) זהה בין התמונות שיש לרשום לבין העתקות פרמטר שינוי הצורה, מכיוון שהשלב הבא יעבור וישנה כל תמונה לפי סדר קובצי פרמטרי ההמרה. לחץ על תוספים | טרנספורמציה | המר פרוסות מחסנית וירטואליות. תחת ספריית מקור, בחר את התיקיה המכילה את התמונות לרישום. תחת ספריית פלט, בחר את התיקיה שנוצרה עבור פלט הרישום. תחת Transforms directory, בחר את התיקייה המכילה את .xml הקבצים עם עותק אחד לכל קובץ תמונה להמרה. שוב, ודא שהסדר תואם את הקבצים (כלומר, עותק אחד של .xml סבב 1 לכל ערוץ סבב 1, עותק אחד של סבב 2 .xml לכל ערוץ סבב 2 וכו’). לחץ על אישור.הערה: לאחר השלמתה, התמונות הרשומות מסיבוב זה יופיעו כערימה (ובתיקיית הפלט). השתמש בפס השקופיות בחלק התחתון כדי לדפדף קדימה ואחורה בין הערוצים. ודא שכל הערוצים השתנו באותו אופן. אם לא, סביר להניח שהסיבה לכך היא קובץ .xml שגוי בספריית ההמרות; במקרה זה, תקן את הקובץ וחזור על הפעולה.הערה: טווח הבהירות המוצג יתבסס על ערוץ אחד, אך הדבר אינו משפיע על התמונות שנשמרו בפועל, אלא רק על הצג. שימו לב שכל התמונות הרשומות מיושרות בהצלחה בין סבבים ומוכנות לניתוח שכבות-על/במורד הזרם.הערה: קיימות דרכים פרוגרמטיות יעילות יותר לביצוע רישום עבור אצוות גדולות. השיטה המוצגת כאן היא פשוט קלה שאינה דורשת תכנות.