В этой статье мы опишем протокол трансплантации и отслеживания меченых нервных клеток в церебральные органоиды человека.
Развитие подходов к трансплантации клеток требует модельных систем, позволяющих точно оценить функциональную активность трансплантированных клеток. Для центральной нервной системы, несмотря на то, что ксенотрансплантация остается современной, такие модели технически сложны, ограничены в пропускной способности и дороги. Более того, присутствующие сигналы окружающей среды не идеально вступают в перекрестную реакцию с клетками человека. В данной работе представлена недорогая, доступная и высокопроизводительная модель трансплантации и отслеживания нервных клеток человека в органоиды головного мозга человека. Эти органоиды могут быть легко получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека с помощью коммерческих наборов и содержат ключевые типы клеток головного мозга.
Сначала мы продемонстрируем этот протокол трансплантации с помощью инъекции меченых EGFP человеческих ИПСК-клеток-предшественников (NPC) в эти органоиды. Далее мы обсудим соображения по отслеживанию роста этих клеток в органоиде с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток и продемонстрируем отслеживание трансплантированных EGFP-меченных NPC в органоиде в течение 4-месячного периода. Наконец, мы представляем протокол секционирования, циклического иммунофлуоресцентного окрашивания и визуализации трансплантированных клеток в их локальном контексте. Представленная здесь модель трансплантации органоидов позволяет в течение длительного времени (не менее 4 месяцев) отслеживать трансплантированные человеческие клетки непосредственно в микросреде человека с помощью недорогого и простого в исполнении протокола. Таким образом, она представляет собой полезную модель как для терапии нервными клетками (трансплантации), так и, вероятно, для моделирования опухолей центральной нервной системы (ЦНС) более точным микроэкологическим способом.
Человеческий мозг представляет собой сложный орган, состоящий из нескольких типов клеток нервной и глиальной линий. Вместе они образуют сложную сеть, которая порождает познание. Существует значительный интерес к трансплантации клеток в эту систему в качестве лечения широкого спектра неврологических расстройств, включая черепно-мозговую травму (ЧМТ)1,2, нейродегенеративные расстройства 3,4,5,6,7 и инсульт8. Однако одним из основных препятствий в продвижении таких стратегий является относительная нехватка доступных доклинических моделей для определения ожидаемых результатов трансплантации. В настоящее время наиболее часто используемыми моделями являются методы культивирования in vitro для определения клеточного потенциала и ксенотрансплантации мышам. Несмотря нато, что методы культивирования клеток позволяют оценить потенциал дифференцировки и самообновления, они проводятся в оптимальных условиях роста, которые не имитируют микроокружение, с которым клетки столкнулись бы в контексте трансплантации. Более того, способ, которым клетки выращиваются, может влиять на их поведение10.
Мозг мыши содержит все клетки микроокружения и, таким образом, является чрезвычайно мощной модельной системой длятрансплантации. Однако существуют важные различия между корой головного мозга мыши и человека12,13, и не все факторы роста перекрестно реагируют между видами. Модели приматов являются более близкой альтернативой, которая лучше имитирует человеческую систему, а также дает важные доклиническиерезультаты. Однако даже эти более близкородственные родственники сохраняют важные различия в клеточномсоставе. Несмотря на то, что обе эти модельные системы дают ценную информацию о поведении клеток во время трансплантации и включают в себя хирургические элементы возможной терапии, они остаются несовершенными. Кроме того, они являются дорогостоящими и технически сложными (т.е. необходимо проводить операции на головном мозге животных), что ограничивает возможную пропускную способность. Кроме того, существует множество этических проблем, связанных с трансплантацией клеток человеческого мозгаживотным16. Культивирование срезов мозга позволяет разрезать один мозг и использовать его для нескольких видов лечения, тем самым устраняя некоторые ограничения трансплантации животных; Тем не менее, они имеют ограниченную продолжительность жизни (недели), по-прежнему животного происхождения и (будучи тонким ломтиком) не обладают достаточным объемом/целостностью поверхности, чтобы имитировать введение клеток17. Таким образом, остается значительный разрыв между чисто клеточными культурами/потенциальными моделями и трансплантацией in vivo.
Церебральные органоиды представляют собой модель in vitro, содержащую основные типы нервных клеток, присутствующих в головном мозге, и могут быть получены в больших количествах из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК)18,19. Таким образом, такие органоиды обеспечивают клеточный контекст, который может позволить оценить функциональную способность тест-клетки, представляющей интерес в условиях трансплантации. Действительно, недавнее исследование показало, что нейронные клетки-предшественники (NPC), трансплантированные в церебральные органоиды человека, выживают, размножаются и дифференцируются аналогично NPC, трансплантированным в мозг мыши с комбинированным иммунодефицитом (NSG)20 с ожирением. Церебральные органоиды, таким образом, представляют собой долгоживущую (>6 месяцев), экономически эффективную систему, которая захватывает типы клеток человеческого мозга. Таким образом, они могут представлять собой идеального реципиента трансплантата для тестирования регенеративной способности нервных клеток на ранней стадии.
В данной работе представлен протокол трансплантации и последующего отслеживания меченых НПК человека в органоиды головного мозга человека (рис. 1). Это начинается с инъекции меченых GFP NPC в зрелые (2-4 месяца) церебральные органоиды18. Затем трансплантированные клетки проходят флуоресцентную микроскопию живых клеток в течение 4 месяцев. В течение этого времени мы показываем как персистенцию клеток в месте инъекции, так и миграцию в дистальные области органоида. В конечной точке мы демонстрируем извлечение, окрашивание и визуализацию антигенов гистологических срезов, полученных из этих органоидов, включая протокол гашения существующих красителей на основе AlexaFluor, чтобы обеспечить дополнительные раунды окрашивания и визуализации, основанные на предыдущей работе21. Таким образом, этот протокол может быть полезен для измерения способности клеток к дифференцировке в условиях трансплантации, долговечности трансплантата, клеточной экспансии in situ и миграции клеток из места трансплантации. Мы ожидаем, что это будет полезно как для применения в регенеративной медицине и клеточной терапии, так и для моделирования опухолей путем имплантации опухолевых клеток в соответствующие регионоспецифичные органоиды.
Учитывая значительный интерес к клеточным терапевтическим подходам для лечения повреждений ЦНС/нейродегенеративных расстройств 1,2,3,4,5,6,7,8, модели функционирования клеток в условиях трансплантации приобретают все большее значение. В данной работе представлен метод трансплантации меченых человеческих NPC в церебральные органоиды человека, а также отслеживание их живых клеток и оценка конечной точки с помощью гистологии и иммунофлуоресцентного окрашивания. Важно отметить, что мы показали, что трансплантированные клетки способны к миграции, дифференцировке и длительной (4 месяца) персистенции в органоидной среде. Такая долговременная персистентность заметно превышает поддерживаемость культур срезов мозга17. Таким образом, эта система подходит для изучения многих моделей поведения, которые необходимо было бы оценить в потенциальной терапевтической обстановке, таких как выживаемость, пролиферация и дифференциация. Действительно, ортогональное исследование недавно продемонстрировало, что трансплантированные NPC ведут себя одинаково в церебральных органоидах по сравнению с NPC, трансплантированными в мозг мышей NSG20, тем самым подтверждая полезность органоидов в качестве реципиента трансплантата. Поскольку это система in vitro, в нее также легко добавлять интересующие вас цитокины или препараты. Это может быть использовано для лучшего понимания воздействия специфических сред, таких как воспаление и иммунодепрессанты, на трансплантированные клетки, чтобы в дальнейшем имитировать то, с чем они могут столкнуться в терапевтических условиях. Протокол циклической иммунофлюоресценции, который мы продемонстрировали (на основе предыдущего исследования21), еще больше расширяет возможности этого подхода, позволяя одновременно оценивать широкий спектр линейных и, возможно, специфических маркеров заболевания в одном срезе и, таким образом, позволяя точно отслеживать трансплантированные клетки и их влияние на ткани. Конечно, вместо этого можно использовать другие методы оценки конечных точек в зависимости от целей анализа. Например, очищение тканей с помощью 3D-реконструкции может быть использовано, если морфология клеток представляет первостепенный интерес, или диссоциация с последующей проточной цитометрией, если конечной целью является количественная оценка конкретных типов клеток. Мы ожидаем, что этот метод будет легко распространяться на другие типы клеток, такие как опухоли ЦНС, что потенциально позволит изучать их в микроэкологическом контексте. Аналогичным образом, органоиды, используемые в качестве реципиентов, могут быть заменены на органоиды модели болезни 25,26,27, что потенциально позволяет моделировать подходы к трансплантации для этих состояний.
Как и у всех моделей, у представленной здесь тоже есть свои ограничения. Во-первых, органоиды, полученные из ИПСК, являютсянезрелыми и, таким образом, имеют важные отличия по сравнению со стареющим мозгом, в котором проявляются многие нейродегенеративные заболевания. Церебральные органоиды также неоднородны в своем развитии19, что исключает последовательное введение в одну и ту же физиологическую нишу. Более того, несмотря на то, что они содержат типы клеток соответствующих областей мозга18,19, в них отсутствуют эндотелиальные, микроглиальные и иммунные компоненты, которые также важны в условиях in vivo 14. Это ограничивает изучение того, как хозяин будет реагировать на трансплантацию клеток. В настоящее время появляются методы добавления сосудистых28 и микроглиальных29 клеток, а также для повышения органоидной консистенции и регионализации18, тем самым улучшая моделирующую способность системы органоидной трансплантации. Тем не менее, они потребуют дальнейшего тестирования и оптимизации, помимо того, что представлено здесь. Несмотря на то, что этот протокол является недорогим и не требует специального оборудования, остается ряд важных технических соображений, таких как глубина впрыска, например. Это связано как с тем, что органоиды не перфузируются и, таким образом, часто имеют некротический центр, если они становятсяслишком большими, так и с тем, что свет не может проникнуть через органоидное ядро для отслеживания живых клеток. Таким образом, клетки, которые были введены слишком глубоко, и колонии, которые мигрировали внутрь, могут быть пропущены. Хотя это может быть улучшено за счет использования более длинноволновых флуорофоров с лучшей проникающей способностью тканей30, в зависимости от размера органоида и аппарата обнаружения, это, вероятно, останется рассмотрением. Наконец, поскольку органоиды головного мозга находятся в стадии развития, время трансплантации является еще одним ключевым фактором, поскольку окружающая среда, вероятно, будет отличаться в зависимости от стадии развития органоида, в который он вводится. Хотя это можно в некоторой степени контролировать, обеспечивая постоянный органоидный возраст во время инъекции, это, без сомнения, фактор, который необходимо учитывать.
Этот протокол недорогой, простой, не требует использования на животных и не требует специализированного оборудования, что делает моделирование трансплантации доступным для более широкого круга лабораторий. Учитывая быстрые темпы развития как в области терапии нервных клеток, так и в системах моделей органоидов, мы ожидаем, что протокол трансплантации органоидов, представленный здесь, станет полезной моделью для целого ряда заболеваний и терапевтических подходов.
The authors have nothing to disclose.
Средства на эту работу были предоставлены через благотворительные фонды IRIC из фонда Марселя и Жана Куту и из Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS #295647). D.J.H.F.K. получает зарплатную поддержку от FRQS в виде стипендии Chercheurs-boursiers Junior 1 (#283502). M.I.I.R. был поддержан докторской премией IRIC от Института исследований в области иммунологии и рака, Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat от Монреальского университета и Bourse de Mérite aux cycles supérieurs.
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | proteolytic-collagenolytic enzyme mix |
Alexa Fluor 488 anti-GFP Antibody | BioLegend | 338008 | |
Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52) | BioLegend | 801804 | |
Alexa Fluor 594 anti-GFAP Antibody (clone SMI 25) | BioLegend | 837510 | |
Alexa Fluor 594 anti-Nestin (clone 10C2) | BioLegend | 656804 | |
Alexa Fluor 647 anti-Tubulin β 3 (TUBB3) (clone TUJ1) | BioLegend | 801209 | |
Citric Acid Monohydrate | Fisher Chemical | A104-500 | |
Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | – | |
Denaturated Ethyl Alcohol (Anhydrous) | ChapTec | – | |
DMEM F12/Glutamax | Thermo | 10565018 | |
Dymethil Sulfoxide (DMSO), Sterile | BioShop | DMS666.100 | |
FIJI 1.53c | – | – | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
Gen5 | – | – | |
HistoCore Arcadia H | Leica Biosystems | – | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | Phenol Red-free, LDEV-free |
MX35 microtome blade | Epredia | 3053835 | |
NaOH | Sigma | 655104 | |
PBS (-Ca -Mg) | Sigma | D8537 | |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo | A1113803 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Abcam | ab120129 | |
Simport Scientific Stainless-Steel Base Molds | Fisher Scientific | 22-038-209 | |
Simport Scientific UNISETTE Biopsy Processing/Embedding Cassette | Fisher Scientific | 36-101-9255 | |
STEMdiff Forebrain Neuron Differentiation Kit | StemCell Technologies | 8600 | |
STEMdiff Neural Progenitor Medium | StemCell Technologies | 5833 | |
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | StemCell Technologies | 8581 | |
Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome | Thermo Scientific | – | |
Tissue Prep | Fisher Scientific | T555 | |
Tissue-Tek VIP 6 AI Tissue Processor | Sakura Finetek | – | |
Toluene (histological) | ChapTec | – | |
Trypan blue; 0.4% (wt/vol) | Thermo | 15250061 | |
Tween 20 | BioShop | TWN510.100 |