Gözenekli Ortamlarda Biyotıkanıklığı İncelemek için Mikroakışkan Bir Platform
Summary
Mevcut protokol, yüksek çözünürlüklü mikroskopi görüntülemeyi eşzamanlı basınç farkı ölçümleriyle birleştirerek yarı-2D gözenekli ortamlarda biyofilm gelişimini incelemek için mikroakışkan bir platformu tanımlamaktadır. Platform, gözenekli ortamlardaki gözenek boyutunun ve sıvı akış hızlarının biyotıkanma üzerindeki etkisini ölçer.
Abstract
Bakteriyel biyofilmler, topraklar ve filtrasyon membranları dahil olmak üzere çeşitli çevresel ve endüstriyel gözenekli ortamlarda bulunur. Biyofilmler belirli akış koşulları altında büyür ve gözenekleri tıkayabilir, böylece yerel sıvı akışını yeniden yönlendirebilir. Biyofilmlerin gözenekleri tıkama yeteneği, biyotıkanma olarak adlandırılır, gözenekli ortamın yerel geçirgenliği üzerinde muazzam bir etkiye sahip olabilir, sistemde bir basınç birikimi yaratabilir ve içinden geçen kütle akışını etkileyebilir. Farklı fiziksel koşullar altında (örneğin, farklı akış hızlarında ve gözenek boyutlarında) biyofilm büyümesi ve sıvı akışı arasındaki etkileşimi anlamak için, bu çalışmada, biyofilm gelişimini dışarıdan dayatılan, kontrollü fiziksel koşullar altında bir mikroskop kullanarak görselleştirmek için mikroakışkan bir platform geliştirilmiştir. Gözenekli ortamdaki biyofilm kaynaklı basınç birikimi, basınç sensörleri kullanılarak aynı anda ölçülebilir ve daha sonra biyofilmin yüzey kaplaması ile ilişkilendirilebilir. Sunulan platform, akış koşulları altında gözenekli ortamlarda biyofilmlerin neden olduğu biyotıkanıklığı araştırmak için sistematik bir yaklaşım için bir temel oluşturur ve çevresel izolatları veya çok türlü biyofilmleri incelemek için uyarlanabilir.
Introduction
Biyofilmler – ekstra-polimerik maddelerin (EPS) kendiliğinden salgılanan bir matrisine gömülü bakteri kolonileri – topraklar ve akiferler1 gibi doğal gözenekli ortamlarda ve biyoremediasyon2, su filtrasyonu3 ve tıbbi cihazlar4 gibi teknik ve tıbbi uygulamalarda her yerde bulunur. Biyofilm matrisi, polisakkaritler, protein lifleri ve hücre dışı DNA 5,6’dan oluşur ve mikroorganizmalara, besin maddelerinin mevcudiyetine ve çevresel koşullara güçlü bir şekilde bağlıdır7. Oysa matrisin işlevleri evrenseldir; Biyofilm yapısının iskelesini oluşturur, mikrobiyal topluluğu mekanik ve kimyasal streslerden korur ve biyofilmlerin reolojik özelliklerinden büyük ölçüde sorumludur5.
Gözenekli ortamlarda, biyofilmlerin büyümesi gözenekleri tıkayabilir ve sözde biyotıkanıklığa neden olabilir. Biyofilm gelişimi, gözenekli ortamın iki sütununu ayıran mesafe olarak tanımlanansıvı akışı ve gözenek boyutu 8,9,10 ile kontrol edilir. Hem gözenek boyutu hem de sıvı akışı, besin taşınımını ve yerel kesme kuvvetlerini kontrol eder. Buna karşılık, büyüyen biyofilm gözenekleri tıkar, sıvının hız dağılımını etkiler 11,12,13, kütle taşımacılığı ve gözenekli ortamın hidrolik iletkenliği 14,15. Hidrolik iletkenlikteki değişiklikler, kapalı sistemlerdeki artan basınçla yansıtılır16,17,18,19. Biyofilm geliştirme ve biyotıkanma konusundaki mevcut mikroakışkan çalışmalar, homojen geometriler16,20 (yani tekil gözenek boyutu ile) veya heterojen gözenekli ortam 12,21,22’deki akış hızlarının etkisini incelemeye odaklanmaktadır. Bununla birlikte, akış hızlarının ve gözenek boyutunun biyofilm gelişimi üzerindeki etkilerini ve biyotıkanmış gözenekli ortamda ortaya çıkan basınç değişikliklerini çözmek için, farklı gözenekli ortam geometrilerinin ve çevresel koşulların paralel olarak incelenmesine izin veren oldukça kontrol edilebilir ve çok yönlü bir deneysel platform gereklidir.
Bu çalışma, basınç ölçümlerini gözenekli ortam içinde gelişen biyofilmin eşzamanlı görüntülenmesi ile birleştiren mikroakışkan bir platform sunmaktadır. Kanal geometrisi tasarımındaki gaz geçirgenliği, biyo-uyumluluk ve esnekliği nedeniyle, polidimetilsiloksandan (PDMS) yapılmış mikroakışkan bir cihaz, gözenekli ortamlarda biyofilm gelişimini incelemek için uygun bir araçtır. Mikroakışkanlar, mikrobiyal habitatların çevresini taklit etmek için fiziksel ve kimyasal koşulların (örneğin, sıvı akışı ve besin konsantrasyonu) yüksek hassasiyetle kontrol edilmesini sağlar23. Ayrıca, mikroakışkan cihazlar optik mikroskop kullanılarak mikrometrik çözünürlükle kolayca görüntülenebilir ve çevrimiçi ölçümlerle (örneğin, yerel basınç) birleştirilebilir.
Bu çalışmada, deneyler, kontrollü empoze edilen akış koşulları altında homojen gözenekli bir ortam analoğundaki gözenek boyutunun etkisini incelemeye odaklanmaktadır. Bir kültür ortamının akışı bir şırınga pompası kullanılarak uygulanır ve mikroakışkan kanaldaki basınç farkı basınç sensörleriyle aynı anda ölçülür. Biyofilm gelişimi, mikroakışkan kanalda Bacillus subtilis’in planktonik bir kültürünün tohumlanmasıyla başlatılır. Gelişen biyofilmin düzenli olarak görüntülenmesi ve görüntü analizi, çeşitli deneysel koşullar altında yüzey kapsamı hakkında gözenek ölçeğinde çözülmüş bilgilerin elde edilmesini sağlar. Basınç değişiminin ilişkili bilgileri ve biyotıkanıklığın derecesi, biyotıkanmış gözenekli ortamların geçirgenlik tahminleri için çok önemli girdiler sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Basınç sensörleri ile birleştirilmiş mikroakışkan gözenekli ortam analogları, gözenekli ortamlarda biyofilm gelişimini incelemek için uygun bir araç sağlar. Mikroakışkan gözenekli ortamın tasarımındaki çok yönlülük, özellikle çap, düzensiz şekiller ve gözenek boyutu dahil olmak üzere sütunların düzenlenmesi, birçok geometrinin araştırılmasına izin verir. Bu geometriler, tek gözeneklerden, farklı doğal (örneğin topraklar) ve endüstriyel (örneğin, membranlar ve filtreler) göze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, SNSF PRIMA hibe 179834 (E.S.’ye), ETH’den (RS’ye), ETH Zürih Araştırma Hibesinden (RS ve J.J.M.’ye) isteğe bağlı fonlamadan ve Eawag’dan (J.J.M.’ye) isteğe bağlı fonlamadan destek kabul etmektedir. Yazarlar, Şekil 1B’deki deney düzeneğini gösterdiği için Roberto Pioli’ye ve silikon gofret hazırlığı için Ela Burmeister’e teşekkür eder.
Materials
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
| Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
| Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
| Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
| Handy | Migros | Detergent solution | |
| Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
| ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
| Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
| Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
| Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
| Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
| mrDev600 developer | Microresist | ||
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
| Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
| Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
| Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
| SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
| Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
References
- Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 17 (4), 247-260 (2019).
- Cunningham, A. B., Sharp, R. R., Hiebert, R., James, G. Subsurface biofilm barriers for the containment and remediation of contaminated groundwater. Bioremediation Journal. 7 (3-4), 151-164 (2003).
- Pronk, W., et al. Gravity-driven membrane filtration for water and wastewater treatment: A review. Water Research. 149, 553-565 (2019).
- Caldara, M., Belgiovine, C., Secchi, E., Rusconi, R. Environmental, microbiological, and immunological features of bacterial biofilms associated with implanted medical devices. Clinical Microbiology and Infection. 35 (2), 00221 (2022).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
- Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (4), 847-867 (2000).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. Journal of Applied Microbiology. 85 (1), 19-28 (1998).
- Thomen, P., et al. Bacterial biofilm under flow: First a physical struggle to stay, then a matter of breathing. PLoS ONE. 12 (4), 0175197 (2017).
- Horn, H., Reiff, H., Morgenroth, E. Simulation of growth and detachment in biofilm systems under defined hydrodynamic conditions. Biotechnology and Bioengineering. 81 (5), 607-617 (2003).
- Thullner, M., Mauclaire, L., Schroth, M. H., Kinzelbach, W., Zeyer, J. Interaction between water flow and spatial distribution of microbial growth in a two-dimensional flow field in saturated porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 58 (3-4), 169-189 (2002).
- Bottero, S., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29 (9), 1069-1086 (2013).
- Durham, W. M., Tranzer, O., Leombruni, A., Stocker, R. Division by fluid incision: Biofilm patch development in porous media. Physics of Fluids. 24 (9), 091107 (2012).
- Coyte, K. Z., Tabuteau, H., Gaffney, E. A., Foster, K. R., Durham, W. M. Microbial competition in porous environments can select against rapid biofilm growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (2), 161-170 (2017).
- Taylor, S. W., Jaffé, P. R. Biofilm growth and the related changes in the physical properties of a porous medium: 1. Experimental investigation. Water Resources Research. 26 (9), 2153-2159 (1990).
- Cunningham, A. B., Characklls, W. G., Abedeen, F., Crawford, D. Influence of biofilm accumulation on porous media hydrodynamics. Environmental Science and Technology. 25 (7), 1305-1311 (1991).
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: Biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (24), 5133-5137 (2012).
- Biswas, I., Sadrzadeh, M., Kumar, A. Impact of bacterial streamers on biofouling of microfluidic filtration systems. Biomicrofluidics. 12 (4), 044116 (2018).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Stewart, T. L., Scott Fogler, H. Pore-scale investigation of biomass plug development and propagation in porous media. Biotechnology and Bioengineering. 77 (5), 577-588 (2002).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Aufrecht, J. A., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14 (6), 0218316 (2019).
- Karimifard, S., Li, X., Elowsky, C., Li, Y. Modeling the impact of evolving biofilms on flow in porous media inside a microfluidic channel. Water Research. 188, 116536 (2021).
- Yawata, Y., Nguyen, J., Stocker, R., Rusconi, R. Microfluidic studies of biofilm formation in dynamic environments. Journal of Bacteriology. 198 (19), 2589-2595 (2016).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Ratkowsky, D. A., Olley, J., McMeekin, T. A., Ball, A. Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures. Journal of Bacteriology. 149 (1), 1-5 (1982).
- Ostvar, S., et al. Investigating the influence of flow rate on biofilm growth in three dimensions using microimaging. Advances in Water Resources. 117, 1-13 (2018).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Iglauer, S., Favretto, S., Spinelli, G., Schena, G., Blunt, M. J. X-ray tomography measurements of power-law cluster size distributions for the nonwetting phase in sandstones. Physical Review E. 82 (5), 10-12 (2010).
- Wu, C., Chu, J., Wu, S., Cheng, L., van Paassen, L. A. Microbially induced calcite precipitation along a circular flow channel under a constant flow condition. Acta Geotechnica. 14 (3), 673-683 (2019).
- Nassar, M. K., et al. Large-scale experiments in microbially induced calcite precipitation (MICP): reactive transport model development and prediction. Water Resources Research. 54 (1), 480-500 (2018).
- Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 21 (1), 27-52 (2022).
