פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר סתימה ביולוגית במדיה נקבובית
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר התפתחות ביופילם במדיה נקבובית כמו-דו-ממדית על ידי שילוב של דימות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה עם מדידות הפרשי לחצים בו זמנית. הפלטפורמה מכמתת את ההשפעה של גודל הנקבוביות וקצב זרימת הנוזלים במדיה נקבובית על סתימה ביולוגית.
Abstract
ביופילמים חיידקיים נמצאים במספר מדיות נקבוביות סביבתיות ותעשייתיות, כולל קרקעות וקרומי סינון. ביופילמים גדלים בתנאי זרימה מסוימים ויכולים לסתום נקבוביות, ובכך לכוון מחדש את זרימת הנוזל המקומית. היכולת של ביופילמים לסתום נקבוביות, מה שמכונה ביו-סתימה, יכולה להיות בעלת השפעה עצומה על החדירות המקומית של התווך הנקבובי, ליצור הצטברות לחץ במערכת ולהשפיע על זרימת המסה דרכו. כדי להבין את יחסי הגומלין בין צמיחת ביופילם וזרימת נוזלים בתנאים פיזיקליים שונים (למשל, במהירויות זרימה שונות ובגדלים שונים של נקבוביות), במחקר הנוכחי פותחה פלטפורמה מיקרופלואידית כדי להמחיש התפתחות ביופילם באמצעות מיקרוסקופ בתנאים פיזיקליים חיצוניים ומבוקרים. ניתן למדוד את הצטברות הלחץ הנגרמת על ידי ביופילם בתווך הנקבובי בו זמנית באמצעות חיישני לחץ, ומאוחר יותר, בקורלציה עם כיסוי פני השטח של הביופילם. הפלטפורמה המוצגת מספקת בסיס לגישה שיטתית לחקר סתימות ביולוגיות הנגרמות על ידי ביופילמים במדיה נקבובית בתנאי זרימה, וניתן להתאים אותה לחקר מבודדים סביבתיים או ביופילמים מרובי מינים.
Introduction
ביופילמים – מושבות חיידקים המשובצות במטריצה מפרישה עצמית של חומרים חוץ-פולימריים (EPS) – נמצאות בכל מקום במדיה נקבובית טבעית, כגון קרקעות ואקוויפרים1, וביישומים טכניים ורפואיים, כגון טיפול ביולוגי2, סינון מים3 ומכשירים רפואיים4. מטריצת הביופילם מורכבת מרב-סוכרים, סיבי חלבון ודנ”א חוץ-תאי5,6, והיא תלויה מאוד במיקרואורגניזמים, בזמינות חומרי המזון ובתנאי הסביבה7. עם זאת, הפונקציות של המטריצה הן אוניברסליות; הוא מהווה את הפיגום של מבנה הביופילם, מגן על קהילת החיידקים מפני לחצים מכניים וכימיים, ואחראי במידה רבה לתכונות הריאולוגיות של הביופילמים5.
במדיה נקבובית, הצמיחה של ביופילמים יכולה לסתום נקבוביות, מה שגורם למה שנקרא bioclogging. התפתחות הביופילם נשלטת על ידי זרימת הנוזל וגודל הנקבוביות, המוגדר כמרחק המפריד בין שני עמודים, של התווך הנקבובי 8,9,10. הן גודל הנקבוביות והן זרימת הנוזלים שולטים בהובלת החומרים המזינים ובכוחות הגזירה המקומיים. בתורו, הביופילם הגדל סותם נקבוביות, ומשפיע על התפלגות המהירות של הנוזל 11,12,13, על הסעת ההמונים ועל המוליכות ההידראולית של התווך הנקבובי 14,15. השינויים במוליכות הידראולית משתקפים באמצעות לחץ מוגבר במערכות סגורות16,17,18,19. מחקרים מיקרופלואידים עכשוויים בפיתוח ביופילם וסתימה ביולוגית מתמקדים בחקר ההשפעה של מהירויות זרימה בגיאומטריות הומוגניות16,20 (כלומר, עם גודל נקבוביות יחיד) או מדיה נקבובית הטרוגנית12,21,22. עם זאת, כדי להתיר את ההשפעות של קצבי הזרימה וגודל הנקבוביות על התפתחות הביופילם ושינויי הלחץ הנובעים מכך בתווך הנקבובי הסתום, נדרשת פלטפורמה ניסיונית רב-תכליתית וניתנת לשליטה המאפשרת לחקור גיאומטריות מדיה נקבוביות שונות ותנאי סביבה במקביל.
המחקר הנוכחי מציג פלטפורמה מיקרופלואידית המשלבת מדידות לחץ עם הדמיה סימולטנית של הביופילם המתפתח בתווך הנקבובי. בשל חדירות הגז, התאימות הביולוגית והגמישות שלו בתכנון גיאומטריית התעלה, התקן מיקרופלואידי העשוי מפולידימתילסילוקסאן (PDMS) הוא כלי מתאים לחקר התפתחות ביופילם במדיה נקבובית. מיקרופלואידיקה מאפשרת בקרה של תנאים פיזיקליים וכימיים (למשל, זרימת נוזלים וריכוז חומרי מזון) בדיוק גבוה כדי לחקות את הסביבה של בתי גידול מיקרוביאליים23. יתר על כן, התקנים מיקרופלואידים ניתן בקלות לצלם עם רזולוציה מיקרומטרית באמצעות מיקרוסקופ אופטי בשילוב עם מדידות מקוונות (למשל, הלחץ המקומי).
בעבודה זו, הניסויים מתמקדים בחקר ההשפעה של גודל הנקבוביות בתווך נקבובי הומוגני אנלוגי בתנאי זרימה כפויים מבוקרים. זרימת מדיום תרבית מוטלת באמצעות משאבת מזרק, והפרש הלחצים דרך התעלה המיקרופלואידית נמדד בו זמנית באמצעות חיישני לחץ. פיתוח ביופילם מתחיל על ידי זריעת תרבית פלנקטונית של Bacillus subtilis בתעלה המיקרופלואידית. הדמיה סדירה של הביופילם המתפתח וניתוח התמונה מאפשרת לקבל מידע מפוענח בקנה מידה נקבובי על כיסוי פני השטח בתנאי ניסוי שונים. המידע המתואם של שינוי הלחץ והיקף הסתימה הביולוגית מספק קלט חיוני להערכות חדירות של מדיה נקבובית סתומה ביולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנלוגים של מדיה נקבובית מיקרופלואידית בשילוב עם חיישני לחץ מספקים כלי מתאים לחקר התפתחות ביופילם במדיה נקבובית. הרבגוניות בעיצוב התווך הנקבובי המיקרופלואידי, במיוחד סידור העמודים, כולל קוטר, צורות לא סדירות וגודל נקבוביות, מאפשרת חקירה של גיאומטריות רבות. גיאומטריות אלה נעות בין נקבובי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על תמיכה מ-SNSF PRIMA grant 179834 (ל-E.S.), מימון לפי שיקול דעת מ-ETH (ל-R.S.), ETH Zurich Research Grant (ל-R.S. ו-J.J.M.), ומימון לפי שיקול דעת מ-Eawag (ל-J.J.M). המחברים רוצים להודות לרוברטו פיולי על הדגמת מערך הניסוי באיור 1B ולאלה בורמייסטר על הכנת פרוסות הסיליקון.
Materials
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
| Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
| Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
| Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
| Handy | Migros | Detergent solution | |
| Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
| ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
| Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
| Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
| Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
| Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
| mrDev600 developer | Microresist | ||
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
| Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
| Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
| Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
| SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
| Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
References
- Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 17 (4), 247-260 (2019).
- Cunningham, A. B., Sharp, R. R., Hiebert, R., James, G. Subsurface biofilm barriers for the containment and remediation of contaminated groundwater. Bioremediation Journal. 7 (3-4), 151-164 (2003).
- Pronk, W., et al. Gravity-driven membrane filtration for water and wastewater treatment: A review. Water Research. 149, 553-565 (2019).
- Caldara, M., Belgiovine, C., Secchi, E., Rusconi, R. Environmental, microbiological, and immunological features of bacterial biofilms associated with implanted medical devices. Clinical Microbiology and Infection. 35 (2), 00221 (2022).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
- Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (4), 847-867 (2000).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. Journal of Applied Microbiology. 85 (1), 19-28 (1998).
- Thomen, P., et al. Bacterial biofilm under flow: First a physical struggle to stay, then a matter of breathing. PLoS ONE. 12 (4), 0175197 (2017).
- Horn, H., Reiff, H., Morgenroth, E. Simulation of growth and detachment in biofilm systems under defined hydrodynamic conditions. Biotechnology and Bioengineering. 81 (5), 607-617 (2003).
- Thullner, M., Mauclaire, L., Schroth, M. H., Kinzelbach, W., Zeyer, J. Interaction between water flow and spatial distribution of microbial growth in a two-dimensional flow field in saturated porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 58 (3-4), 169-189 (2002).
- Bottero, S., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29 (9), 1069-1086 (2013).
- Durham, W. M., Tranzer, O., Leombruni, A., Stocker, R. Division by fluid incision: Biofilm patch development in porous media. Physics of Fluids. 24 (9), 091107 (2012).
- Coyte, K. Z., Tabuteau, H., Gaffney, E. A., Foster, K. R., Durham, W. M. Microbial competition in porous environments can select against rapid biofilm growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (2), 161-170 (2017).
- Taylor, S. W., Jaffé, P. R. Biofilm growth and the related changes in the physical properties of a porous medium: 1. Experimental investigation. Water Resources Research. 26 (9), 2153-2159 (1990).
- Cunningham, A. B., Characklls, W. G., Abedeen, F., Crawford, D. Influence of biofilm accumulation on porous media hydrodynamics. Environmental Science and Technology. 25 (7), 1305-1311 (1991).
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: Biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (24), 5133-5137 (2012).
- Biswas, I., Sadrzadeh, M., Kumar, A. Impact of bacterial streamers on biofouling of microfluidic filtration systems. Biomicrofluidics. 12 (4), 044116 (2018).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Stewart, T. L., Scott Fogler, H. Pore-scale investigation of biomass plug development and propagation in porous media. Biotechnology and Bioengineering. 77 (5), 577-588 (2002).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Aufrecht, J. A., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14 (6), 0218316 (2019).
- Karimifard, S., Li, X., Elowsky, C., Li, Y. Modeling the impact of evolving biofilms on flow in porous media inside a microfluidic channel. Water Research. 188, 116536 (2021).
- Yawata, Y., Nguyen, J., Stocker, R., Rusconi, R. Microfluidic studies of biofilm formation in dynamic environments. Journal of Bacteriology. 198 (19), 2589-2595 (2016).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Ratkowsky, D. A., Olley, J., McMeekin, T. A., Ball, A. Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures. Journal of Bacteriology. 149 (1), 1-5 (1982).
- Ostvar, S., et al. Investigating the influence of flow rate on biofilm growth in three dimensions using microimaging. Advances in Water Resources. 117, 1-13 (2018).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Iglauer, S., Favretto, S., Spinelli, G., Schena, G., Blunt, M. J. X-ray tomography measurements of power-law cluster size distributions for the nonwetting phase in sandstones. Physical Review E. 82 (5), 10-12 (2010).
- Wu, C., Chu, J., Wu, S., Cheng, L., van Paassen, L. A. Microbially induced calcite precipitation along a circular flow channel under a constant flow condition. Acta Geotechnica. 14 (3), 673-683 (2019).
- Nassar, M. K., et al. Large-scale experiments in microbially induced calcite precipitation (MICP): reactive transport model development and prediction. Water Resources Research. 54 (1), 480-500 (2018).
- Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 21 (1), 27-52 (2022).
