Une plateforme microfluidique pour étudier le biocolmatage en milieu poreux
Summary
Le présent protocole décrit une plateforme microfluidique pour étudier le développement de biofilms dans des milieux poreux quasi-2D en combinant l’imagerie microscopique à haute résolution avec des mesures simultanées de différence de pression. La plateforme quantifie l’influence de la taille des pores et des débits de fluide dans les milieux poreux sur le biocolmatage.
Abstract
Les biofilms bactériens se trouvent dans plusieurs milieux poreux environnementaux et industriels, y compris les sols et les membranes de filtration. Les biofilms se développent dans certaines conditions d’écoulement et peuvent obstruer les pores, redirigeant ainsi l’écoulement local du fluide. La capacité des biofilms à obstruer les pores, ce qu’on appelle le biocolmatage, peut avoir un effet considérable sur la perméabilité locale du milieu poreux, créant une accumulation de pression dans le système et ayant un impact sur le flux massique qui le traverse. Pour comprendre l’interaction entre la croissance du biofilm et l’écoulement du fluide dans différentes conditions physiques (p. ex., à différentes vitesses d’écoulement et tailles de pores), dans la présente étude, une plateforme microfluidique est développée pour visualiser le développement du biofilm à l’aide d’un microscope dans des conditions physiques contrôlées imposées de l’extérieur. L’accumulation de pression induite par le biofilm dans le milieu poreux peut être mesurée simultanément à l’aide de capteurs de pression et, plus tard, corrélée avec la couverture de surface du biofilm. La plateforme présentée fournit une base de référence pour une approche systématique visant à étudier le biocolmatage causé par les biofilms dans les milieux poreux dans des conditions d’écoulement et peut être adaptée à l’étude d’isolats environnementaux ou de biofilms multi-espèces.
Introduction
Les biofilms – colonies bactériennes intégrées dans une matrice autosécrétée de substances extra-polymères (PSE) – sont omniprésents dans les milieux poreux naturels, tels que les sols et les aquifères1, et les applications techniques et médicales, telles que la bioremédiation2, la filtration de l’eau3 et les dispositifs médicaux4. La matrice du biofilm est composée de polysaccharides, de fibres protéiques et d’ADN extracellulaire5,6, et dépend fortement des micro-organismes, de la disponibilité des nutriments, ainsi que des conditions environnementales7. Pourtant, les fonctions de la matrice sont universelles; Il forme l’échafaudage de la structure du biofilm, protège la communauté microbienne des contraintes mécaniques et chimiques et est en grande partie responsable des propriétés rhéologiques des biofilms5.
Dans les milieux poreux, la croissance de biofilms peut obstruer les pores, provoquant ce qu’on appelle le biocolmatage. Le développement du biofilm est contrôlé par l’écoulement du fluide et la taille des pores, définis comme la distance séparant deux piliers, du milieu poreux 8,9,10. La taille des pores et l’écoulement du fluide contrôlent le transport des nutriments et les forces de cisaillement locales. À son tour, le biofilm en croissance obstrue les pores, affectant la distribution de vitesse du fluide 11,12,13, le transport de masse et la conductivité hydraulique du milieu poreux 14,15. Les changements de conductivité hydraulique se traduisent par une augmentation de la pression dans les systèmes confinés16,17,18,19. Les études microfluidiques actuelles sur le développement de biofilms et le biocolmatage se concentrent sur l’étude de l’impact des vitesses d’écoulement dans des géométries homogènes16,20 (c’est-à-dire avec une taille de pores singulière) ou des milieux poreux hétérogènes12,21,22. Cependant, pour démêler les effets des débits et de la taille des pores sur le développement du biofilm et les changements de pression qui en résultent dans le milieu poreux biobouché, une plate-forme expérimentale hautement contrôlable et polyvalente permettant l’étude de différentes géométries de milieux poreux et conditions environnementales en parallèle est nécessaire.
La présente étude présente une plateforme microfluidique qui combine des mesures de pression avec l’imagerie simultanée du biofilm en évolution dans le milieu poreux. En raison de sa perméabilité aux gaz, de sa biocompatibilité et de sa flexibilité dans la conception de la géométrie du canal, un dispositif microfluidique en polydiméthylsiloxane (PDMS) est un outil approprié pour étudier le développement de biofilms dans des milieux poreux. La microfluidique permet de contrôler les conditions physiques et chimiques (p. ex., l’écoulement des fluides et la concentration en éléments nutritifs) avec une grande précision pour imiter l’environnement des habitats microbiens23. De plus, les dispositifs microfluidiques peuvent facilement être imagés avec une résolution micrométrique à l’aide d’un microscope optique et couplés à des mesures en ligne (par exemple, la pression locale).
Dans ce travail, les expériences se concentrent sur l’étude de l’impact de la taille des pores dans un milieu poreux homogène analogue dans des conditions d’écoulement imposé contrôlé. Le débit d’un milieu de culture est imposé à l’aide d’une pompe à seringue et la différence de pression à travers le canal microfluidique est mesurée simultanément avec des capteurs de pression. Le développement du biofilm est initié par l’ensemencement d’une culture planctonique de Bacillus subtilis dans le canal microfluidique. L’imagerie régulière du biofilm en évolution et l’analyse d’images permettent d’obtenir des informations résolues à l’échelle des pores sur la couverture de surface dans diverses conditions expérimentales. Les informations corrélées sur le changement de pression et l’étendue du biocolmatage fournissent des données cruciales pour les estimations de la perméabilité des milieux poreux bioobstrués.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les analogues de milieux poreux microfluidiques couplés à des capteurs de pression fournissent un outil approprié pour étudier le développement du biofilm dans les milieux poreux. La polyvalence dans la conception du milieu poreux microfluidique, en particulier la disposition des piliers, y compris le diamètre, les formes irrégulières et la taille des pores, permet l’étude de nombreuses géométries. Ces géométries vont des pores simples aux obstacles très complexes et disposés de manière irrégulière im…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs saluent le soutien de la 179834 de subsides PRIMA du FNS (à E.S.), le financement discrétionnaire de l’ETH (à la R.S.), le Zurich Research Grant (à R.S. et J.J.M.) et le financement discrétionnaire de l’Eawag (à J.J.M.). Les auteurs tiennent à remercier Roberto Pioli pour avoir illustré la configuration expérimentale de la figure 1B et Ela Burmeister pour la préparation de la plaquette de silicium.
Materials
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
| Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
| Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
| Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
| Handy | Migros | Detergent solution | |
| Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
| ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
| Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
| Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
| Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
| Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
| mrDev600 developer | Microresist | ||
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
| Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
| Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
| Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
| SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
| Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
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