Микрофлюидная платформа для изучения биозасорения пористых сред
Summary
Настоящий протокол описывает микрофлюидную платформу для изучения развития биопленки в квази-2D пористых средах путем сочетания микроскопической визуализации высокого разрешения с одновременными измерениями разности давлений. Платформа количественно оценивает влияние размера пор и скорости потока жидкости в пористых средах на биозасорение.
Abstract
Бактериальные биопленки обнаруживаются в нескольких экологических и промышленных пористых средах, включая почвы и фильтрующие мембраны. Биопленки растут при определенных условиях течения и могут закупоривать поры, тем самым перенаправляя локальный поток жидкости. Способность биопленок закупоривать поры, так называемое биозасорение, может оказывать огромное влияние на локальную проницаемость пористой среды, создавая нарастание давления в системе и влияя на массовый поток через нее. Чтобы понять взаимодействие между ростом биопленки и потоком жидкости в различных физических условиях (например, при разных скоростях потока и размерах пор), в настоящем исследовании разработана микрофлюидная платформа для визуализации развития биопленки с использованием микроскопа в контролируемых извне, контролируемых физических условиях. Индуцированное биопленкой накопление давления в пористой среде может быть измерено одновременно с помощью датчиков давления и, позднее, коррелировано с поверхностным покрытием биопленки. Представленная платформа обеспечивает основу для системного подхода к исследованию биозасорения, вызванного биопленками в пористых средах в условиях течения, и может быть адаптирована для изучения изолятов окружающей среды или многовидовых биопленок.
Introduction
Биопленки – бактериальные колонии, встроенные в самосекретируемую матрицу экстраполимерных веществ (EPS) – повсеместно используются в природных пористых средах, таких как почвы и водоносные горизонты1, а также в технических и медицинских применениях, таких как биоремедиация2, фильтрация воды3 и медицинские устройства4. Матрица биопленки состоит из полисахаридов, белковых волокон и внеклеточной ДНК5,6 и сильно зависит от микроорганизмов, наличия питательных веществ, а также условий окружающей среды7. Тем не менее, функции матрицы универсальны; Он образует каркас структуры биопленки, защищает микробное сообщество от механических и химических воздействий и в значительной степени отвечает за реологические свойства биопленок5.
В пористых средах рост биопленок может закупоривать поры, вызывая так называемое биозасорение. Развитие биопленки контролируется потоком жидкости и размером пор, определяемым как расстояние, разделяющее два столба, пористой среды 8,9,10. Как размер пор, так и поток жидкости контролируют перенос питательных веществ и локальные силы сдвига. В свою очередь, растущая биопленка закупоривает поры, влияя на распределение скоростей жидкости 11,12,13, массоперенос и гидравлическую проводимость пористой среды 14,15. Изменения гидравлической проводимости отражаются через повышение давления в замкнутых системах16,17,18,19. Современные микрофлюидные исследования в области развития биопленки и биозасорения сосредоточены на изучении влияния скоростей потока в однородных геометрических формах16,20 (т.е. с особым размером пор) или гетерогенных пористых средах12,21,22. Однако для того, чтобы распутать влияние скоростей потока и размера пор на развитие биопленки и результирующие изменения давления в биозасоренной пористой среде, требуется высококонтролируемая и универсальная экспериментальная платформа, позволяющая параллельно изучать различные геометрии пористых сред и условия окружающей среды.
В настоящем исследовании представлена микрофлюидная платформа, которая сочетает в себе измерения давления с одновременной визуализацией развивающейся биопленки в пористой среде. Благодаря своей газопроницаемости, биосовместимости и гибкости в конструкции геометрии канала микрофлюидное устройство из полидиметилсилоксана (PDMS) является подходящим инструментом для изучения развития биопленки в пористых средах. Микрофлюидика позволяет контролировать физические и химические условия (например, поток жидкости и концентрацию питательных веществ) с высокой точностью, имитируя среду микробных местообитаний23. Кроме того, микрофлюидные устройства могут быть легко отображены с микрометрическим разрешением с использованием оптического микроскопа и объединены с онлайн-измерениями (например, локальным давлением).
В данной работе эксперименты сосредоточены на изучении влияния размера пор в однородной пористой среде-аналоге при контролируемых условиях навязанного течения. Поток питательной среды нагнетается с помощью шприцевого насоса, а перепад давления через микрофлюидный канал измеряется одновременно датчиками давления. Развитие биопленки инициируется посевом планктонной культуры Bacillus subtilis в микрофлюидный канал. Регулярная визуализация развивающейся биопленки и анализ изображений позволяет получить информацию о покрытии поверхности в различных экспериментальных условиях. Коррелированная информация об изменении давления и степени биозасорения дает важные исходные данные для оценки проницаемости биозасоренных пористых сред.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микрофлюидные пористые аналоги в сочетании с датчиками давления обеспечивают подходящий инструмент для изучения развития биопленки в пористых средах. Универсальность конструкции микрофлюидной пористой среды, в частности, расположение столбов, включая диаметр, неправильные формы и ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность за поддержку со стороны грантовой 179834 SNSF PRIMA (для E.S.), дискреционное финансирование от ETH (для R.S.), ETH Zurich research grant (для R.S. и J.J.M.) и дискреционное финансирование от Eawag (для J.J.M.). Авторы хотели бы поблагодарить Роберто Пиоли за иллюстрацию экспериментальной установки на рисунке 1B и Элу Бурмейстер за приготовление кремниевой пластины.
Materials
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
| Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
| Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
| Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
| Handy | Migros | Detergent solution | |
| Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
| ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
| Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
| Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
| Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
| Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
| mrDev600 developer | Microresist | ||
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
| Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
| Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
| Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
| SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
| Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
References
- Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 17 (4), 247-260 (2019).
- Cunningham, A. B., Sharp, R. R., Hiebert, R., James, G. Subsurface biofilm barriers for the containment and remediation of contaminated groundwater. Bioremediation Journal. 7 (3-4), 151-164 (2003).
- Pronk, W., et al. Gravity-driven membrane filtration for water and wastewater treatment: A review. Water Research. 149, 553-565 (2019).
- Caldara, M., Belgiovine, C., Secchi, E., Rusconi, R. Environmental, microbiological, and immunological features of bacterial biofilms associated with implanted medical devices. Clinical Microbiology and Infection. 35 (2), 00221 (2022).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
- Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (4), 847-867 (2000).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. Journal of Applied Microbiology. 85 (1), 19-28 (1998).
- Thomen, P., et al. Bacterial biofilm under flow: First a physical struggle to stay, then a matter of breathing. PLoS ONE. 12 (4), 0175197 (2017).
- Horn, H., Reiff, H., Morgenroth, E. Simulation of growth and detachment in biofilm systems under defined hydrodynamic conditions. Biotechnology and Bioengineering. 81 (5), 607-617 (2003).
- Thullner, M., Mauclaire, L., Schroth, M. H., Kinzelbach, W., Zeyer, J. Interaction between water flow and spatial distribution of microbial growth in a two-dimensional flow field in saturated porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 58 (3-4), 169-189 (2002).
- Bottero, S., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29 (9), 1069-1086 (2013).
- Durham, W. M., Tranzer, O., Leombruni, A., Stocker, R. Division by fluid incision: Biofilm patch development in porous media. Physics of Fluids. 24 (9), 091107 (2012).
- Coyte, K. Z., Tabuteau, H., Gaffney, E. A., Foster, K. R., Durham, W. M. Microbial competition in porous environments can select against rapid biofilm growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (2), 161-170 (2017).
- Taylor, S. W., Jaffé, P. R. Biofilm growth and the related changes in the physical properties of a porous medium: 1. Experimental investigation. Water Resources Research. 26 (9), 2153-2159 (1990).
- Cunningham, A. B., Characklls, W. G., Abedeen, F., Crawford, D. Influence of biofilm accumulation on porous media hydrodynamics. Environmental Science and Technology. 25 (7), 1305-1311 (1991).
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: Biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (24), 5133-5137 (2012).
- Biswas, I., Sadrzadeh, M., Kumar, A. Impact of bacterial streamers on biofouling of microfluidic filtration systems. Biomicrofluidics. 12 (4), 044116 (2018).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Stewart, T. L., Scott Fogler, H. Pore-scale investigation of biomass plug development and propagation in porous media. Biotechnology and Bioengineering. 77 (5), 577-588 (2002).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Aufrecht, J. A., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14 (6), 0218316 (2019).
- Karimifard, S., Li, X., Elowsky, C., Li, Y. Modeling the impact of evolving biofilms on flow in porous media inside a microfluidic channel. Water Research. 188, 116536 (2021).
- Yawata, Y., Nguyen, J., Stocker, R., Rusconi, R. Microfluidic studies of biofilm formation in dynamic environments. Journal of Bacteriology. 198 (19), 2589-2595 (2016).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Ratkowsky, D. A., Olley, J., McMeekin, T. A., Ball, A. Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures. Journal of Bacteriology. 149 (1), 1-5 (1982).
- Ostvar, S., et al. Investigating the influence of flow rate on biofilm growth in three dimensions using microimaging. Advances in Water Resources. 117, 1-13 (2018).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Iglauer, S., Favretto, S., Spinelli, G., Schena, G., Blunt, M. J. X-ray tomography measurements of power-law cluster size distributions for the nonwetting phase in sandstones. Physical Review E. 82 (5), 10-12 (2010).
- Wu, C., Chu, J., Wu, S., Cheng, L., van Paassen, L. A. Microbially induced calcite precipitation along a circular flow channel under a constant flow condition. Acta Geotechnica. 14 (3), 673-683 (2019).
- Nassar, M. K., et al. Large-scale experiments in microbially induced calcite precipitation (MICP): reactive transport model development and prediction. Water Resources Research. 54 (1), 480-500 (2018).
- Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 21 (1), 27-52 (2022).
