منصة الموائع الدقيقة لدراسة الانسداد الحيوي في الوسائط المسامية
Summary
يصف هذا البروتوكول منصة الموائع الدقيقة لدراسة تطور الأغشية الحيوية في الوسائط المسامية شبه 2D من خلال الجمع بين التصوير المجهري عالي الدقة وقياسات فرق الضغط المتزامنة. تحدد المنصة تأثير حجم المسام ومعدلات تدفق السوائل في الوسائط المسامية على الانسداد الحيوي.
Abstract
توجد الأغشية الحيوية البكتيرية في العديد من الوسائط المسامية البيئية والصناعية ، بما في ذلك التربة وأغشية الترشيح. تنمو الأغشية الحيوية في ظل ظروف تدفق معينة ويمكن أن تسد المسام ، وبالتالي تعيد توجيه تدفق السوائل المحلي. يمكن أن يكون لقدرة الأغشية الحيوية على سد المسام ، ما يسمى بالانسداد الحيوي ، تأثير هائل على النفاذية المحلية للوسط المسامي ، مما يؤدي إلى تراكم الضغط في النظام ، والتأثير على تدفق الكتلة من خلاله. لفهم التفاعل بين نمو الأغشية الحيوية وتدفق السوائل في ظل ظروف فيزيائية مختلفة (على سبيل المثال ، بسرعات تدفق وأحجام مسامية مختلفة) ، في هذه الدراسة ، تم تطوير منصة الموائع الدقيقة لتصور تطور الأغشية الحيوية باستخدام مجهر في ظل ظروف فيزيائية محكومة من الخارج. يمكن قياس تراكم الضغط الناجم عن الأغشية الحيوية في الوسط المسامي في وقت واحد باستخدام أجهزة استشعار الضغط ، وفي وقت لاحق ، يرتبط بالتغطية السطحية للغشاء الحيوي. توفر المنصة المقدمة خط أساس لنهج منهجي للتحقيق في الانسداد البيولوجي الناجم عن الأغشية الحيوية في الوسائط المسامية في ظل ظروف التدفق ويمكن تكييفها لدراسة العزلات البيئية أو الأغشية الحيوية متعددة الأنواع.
Introduction
الأغشية الحيوية – المستعمرات البكتيرية المضمنة في مصفوفة ذاتية الإفراز من المواد خارج البوليمر (EPS) – موجودة في كل مكان في الوسائط المسامية الطبيعية ، مثل التربة وطبقات المياه الجوفية1 ، والتطبيقات التقنية والطبية ، مثل المعالجة البيولوجية2 ، وترشيح المياه3 والأجهزة الطبية4. تتكون مصفوفة الأغشية الحيوية من السكريات والألياف البروتينية والحمض النووي خارج الخلية 5,6 ، وتعتمد بشدة على الكائنات الحية الدقيقة ، وتوافر العناصر الغذائية ، وكذلك الظروف البيئية7. ومع ذلك ، فإن وظائف المصفوفة عالمية. إنه يشكل سقالة هيكل الأغشية الحيوية ، ويحمي المجتمع الميكروبي من الضغوط الميكانيكية والكيميائية ، وهو مسؤول إلى حد كبير عن الخصائص الريولوجية للأغشية الحيوية5.
في الوسائط المسامية ، يمكن أن يؤدي نمو الأغشية الحيوية إلى انسداد المسام ، مما يتسبب في ما يسمى بالانسداد الحيوي. يتم التحكم في تطوير الأغشية الحيوية من خلال تدفق السوائل وحجم المسام ، والذي يعرف بأنه المسافة التي تفصل بين عمودين ، للوسط المسامي8،9،10. يتحكم كل من حجم المسام وتدفق السوائل في نقل المغذيات وقوى القص المحلية. في المقابل ، يسد الغشاء الحيوي المتنامي المسام ، مما يؤثر على توزيع سرعة السائل 11،12،13 ، والنقل الجماعي ، والتوصيل الهيدروليكي للوسط المسامي14,15. تنعكس التغيرات في الموصلية الهيدروليكية من خلال زيادة الضغط في الأنظمة المحصورة16،17،18،19. تركز دراسات الموائع الدقيقة الحالية في تطوير الأغشية الحيوية والانسداد الحيوي على دراسة تأثير سرعات التدفق في الأشكال الهندسية المتجانسة16،20 (أي بحجم مسام مفرد) أو الوسائط المسامية غير المتجانسة12،21،22. ومع ذلك ، لفصل آثار معدلات التدفق وحجم المسام على تطور الأغشية الحيوية وتغيرات الضغط الناتجة في الوسط المسامي المسدود بيولوجيا ، يلزم وجود منصة تجريبية متعددة الاستخدامات يمكن التحكم فيها بدرجة عالية تسمح بدراسة مختلف أشكال هندسة الوسائط المسامية والظروف البيئية بالتوازي.
تقدم الدراسة الحالية منصة الموائع الدقيقة التي تجمع بين قياسات الضغط والتصوير المتزامن للغشاء الحيوي المتطور داخل الوسط المسامي. نظرا لنفاذية الغاز والتوافق الحيوي والمرونة في تصميم هندسة القناة ، فإن جهاز الموائع الدقيقة المصنوع من polydimethylsiloxane (PDMS) هو أداة مناسبة لدراسة تطور الأغشية الحيوية في الوسائط المسامية. تسمح الموائع الدقيقة بالتحكم في الظروف الفيزيائية والكيميائية (على سبيل المثال ، تدفق السوائل وتركيز المغذيات) بدقة عالية لمحاكاة بيئة الموائل الميكروبية23. علاوة على ذلك ، يمكن بسهولة تصوير أجهزة الموائع الدقيقة بدقة ميكرومترية باستخدام مجهر ضوئي وإلى جانب القياسات عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، الضغط المحلي).
في هذا العمل ، تركز التجارب على دراسة تأثير حجم المسام في نظير وسط مسامي متجانس في ظل ظروف التدفق المفروضة الخاضعة للرقابة. يتم فرض تدفق وسط الاستزراع باستخدام مضخة حقنة ، ويتم قياس فرق الضغط عبر قناة الموائع الدقيقة في وقت واحد مع أجهزة استشعار الضغط. يبدأ تطوير الأغشية الحيوية عن طريق زرع مستنبتة العوالق من العصوية الرقيقة في قناة الموائع الدقيقة. يسمح التصوير المنتظم للأغشية الحيوية المتطورة وتحليل الصور للمرء بالحصول على معلومات عن مقياس المسام حول تغطية السطح في ظل ظروف تجريبية مختلفة. توفر المعلومات المرتبطة بتغير الضغط ومدى الانسداد البيولوجي مدخلات حاسمة لتقديرات نفاذية الوسائط المسامية المسدودة بيولوجيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر نظائر الوسائط المسامية Microfluidic إلى جانب أجهزة استشعار الضغط أداة مناسبة لدراسة تطور الأغشية الحيوية في الوسائط المسامية. يسمح التنوع في تصميم الوسط المسامي للسوائع الدقيقة ، وتحديدا ترتيب الأعمدة ، بما في ذلك القطر والأشكال غير المنتظمة وحجم المسام ، بالتحقيق في العديد من الأشكال ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بالدعم المقدم من SNSF PRIMA Grant 179834 (إلى E.S.) ، والتمويل التقديري من ETH (إلى RS) ، ومنحة ETH Zurich Research Grant (إلى RS و JJM) ، والتمويل التقديري من Eawag (إلى JJM). يود المؤلفون أن يشكروا روبرتو بيولي على توضيح الإعداد التجريبي في الشكل 1B و Ela Burmeister على تحضير رقاقة السيليكون.
Materials
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
| Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
| Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
| Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
| Handy | Migros | Detergent solution | |
| Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
| ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
| Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
| Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
| Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
| Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
| mrDev600 developer | Microresist | ||
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
| Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
| Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
| Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
| SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
| Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
References
- Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 17 (4), 247-260 (2019).
- Cunningham, A. B., Sharp, R. R., Hiebert, R., James, G. Subsurface biofilm barriers for the containment and remediation of contaminated groundwater. Bioremediation Journal. 7 (3-4), 151-164 (2003).
- Pronk, W., et al. Gravity-driven membrane filtration for water and wastewater treatment: A review. Water Research. 149, 553-565 (2019).
- Caldara, M., Belgiovine, C., Secchi, E., Rusconi, R. Environmental, microbiological, and immunological features of bacterial biofilms associated with implanted medical devices. Clinical Microbiology and Infection. 35 (2), 00221 (2022).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
- Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (4), 847-867 (2000).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. Journal of Applied Microbiology. 85 (1), 19-28 (1998).
- Thomen, P., et al. Bacterial biofilm under flow: First a physical struggle to stay, then a matter of breathing. PLoS ONE. 12 (4), 0175197 (2017).
- Horn, H., Reiff, H., Morgenroth, E. Simulation of growth and detachment in biofilm systems under defined hydrodynamic conditions. Biotechnology and Bioengineering. 81 (5), 607-617 (2003).
- Thullner, M., Mauclaire, L., Schroth, M. H., Kinzelbach, W., Zeyer, J. Interaction between water flow and spatial distribution of microbial growth in a two-dimensional flow field in saturated porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 58 (3-4), 169-189 (2002).
- Bottero, S., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29 (9), 1069-1086 (2013).
- Durham, W. M., Tranzer, O., Leombruni, A., Stocker, R. Division by fluid incision: Biofilm patch development in porous media. Physics of Fluids. 24 (9), 091107 (2012).
- Coyte, K. Z., Tabuteau, H., Gaffney, E. A., Foster, K. R., Durham, W. M. Microbial competition in porous environments can select against rapid biofilm growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (2), 161-170 (2017).
- Taylor, S. W., Jaffé, P. R. Biofilm growth and the related changes in the physical properties of a porous medium: 1. Experimental investigation. Water Resources Research. 26 (9), 2153-2159 (1990).
- Cunningham, A. B., Characklls, W. G., Abedeen, F., Crawford, D. Influence of biofilm accumulation on porous media hydrodynamics. Environmental Science and Technology. 25 (7), 1305-1311 (1991).
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: Biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (24), 5133-5137 (2012).
- Biswas, I., Sadrzadeh, M., Kumar, A. Impact of bacterial streamers on biofouling of microfluidic filtration systems. Biomicrofluidics. 12 (4), 044116 (2018).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Stewart, T. L., Scott Fogler, H. Pore-scale investigation of biomass plug development and propagation in porous media. Biotechnology and Bioengineering. 77 (5), 577-588 (2002).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Aufrecht, J. A., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14 (6), 0218316 (2019).
- Karimifard, S., Li, X., Elowsky, C., Li, Y. Modeling the impact of evolving biofilms on flow in porous media inside a microfluidic channel. Water Research. 188, 116536 (2021).
- Yawata, Y., Nguyen, J., Stocker, R., Rusconi, R. Microfluidic studies of biofilm formation in dynamic environments. Journal of Bacteriology. 198 (19), 2589-2595 (2016).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Ratkowsky, D. A., Olley, J., McMeekin, T. A., Ball, A. Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures. Journal of Bacteriology. 149 (1), 1-5 (1982).
- Ostvar, S., et al. Investigating the influence of flow rate on biofilm growth in three dimensions using microimaging. Advances in Water Resources. 117, 1-13 (2018).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Iglauer, S., Favretto, S., Spinelli, G., Schena, G., Blunt, M. J. X-ray tomography measurements of power-law cluster size distributions for the nonwetting phase in sandstones. Physical Review E. 82 (5), 10-12 (2010).
- Wu, C., Chu, J., Wu, S., Cheng, L., van Paassen, L. A. Microbially induced calcite precipitation along a circular flow channel under a constant flow condition. Acta Geotechnica. 14 (3), 673-683 (2019).
- Nassar, M. K., et al. Large-scale experiments in microbially induced calcite precipitation (MICP): reactive transport model development and prediction. Water Resources Research. 54 (1), 480-500 (2018).
- Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 21 (1), 27-52 (2022).
