Eine Proteinsuspensions-Trapping-Probenvorbereitung für die Tränenproteomik mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie

Die Probanden gaben vor der Teilnahme an der Studie eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Studie wurde von der Humanethikkommission der Hong Kong Polytechnic University genehmigt und entsprach den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki. 1. Entnahme der menschlichen Tränenflüssigkeit mit Schirmer-Streifen Tragen Sie Handschuhe und desinfizieren Sie, um eine Kontamination der Probe zu vermeiden. Vergewissern Sie sich, dass die Innenverpackung intakt, steril und nicht abgelaufen ist. Biegen Sie die Oberseite des Schirmer-Streifens bei der 0-mm-Markierung leicht nach innen, wie in der Nähe der halbkreisförmigen Spitze des Streifens angezeigt (Abbildung 1). Entfernen Sie den Streifen aus der Innenverpackung, indem Sie das Ende des Streifens festhalten, und vermeiden Sie den direkten Kontakt mit dem Probenentnahmebereich von 0 bis 25 mm. Bitten Sie die Person, den Blick von der Position des zu platzierenden Streifens abzuwenden. Ziehen Sie das untere Augenlid vorsichtig nach unten und haken Sie das Ende des Streifens im unteren Fornix in der Nähe der lateralen Canthusregion ein (Abbildung 2). Wiederholen Sie den gleichen Vorgang am anderen Auge. Bitten Sie die Person, die Augenlider vorsichtig zu schließen, um Reizungen zu minimieren. Es wird Tränenflüssigkeit für ca. 5 min oder vorzugsweise 15-20 mm Tränenprobe entnommen. Bitten Sie die Versuchsperson, beide Augen zu öffnen, das untere Augenlid sanft nach unten zu ziehen und die Streifen von der Versuchsperson zu entfernen. Kontrollieren Sie die hydratisierte Länge auf dem Schirmer-Streifen und notieren Sie die gesammelte Menge in mm. Trocknen Sie den Streifen mit einer handelsüblichen, sauberen Rahmenheizung, bis die Flüssigkeit vollständig getrocknet ist.HINWEIS: Übermäßige Erhitzung, die das Filterpapier möglicherweise verkohlen könnte, sollte vermieden werden. Legen Sie jeden getrockneten Schirmer-Streifen in ein beschriftetes Kryoröhrchen und lagern Sie ihn bis zur Weiterverarbeitung vorzugsweise an einem kühlen, trockenen Ort im Dunkeln. 2. Herstellung von Chemikalien und Reagenzien Lysepuffer (5 % SDS, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 mlPipettieren Sie 1 ml 1 M TEAB und 80 μl 12%ige Phosphorsäure. Vortex und kurz beschallen, um Blasen zu entfernen. Bis zu 20 ml mit deionisiertem Wasser auffüllen. 1 g SDS abwiegen und unter Oszillation zur Lösung geben, bis sie sich aufgelöst hat. Proteinfällungspuffer (90% Methanol, 100 mM TEAB, pH 7,1), 10 mL893 μl 1 M TEAB und 92 μl deionisiertes Wasser hinzufügen. 15 μl 85 Gew.-% Phosphorsäure und 9 mL Methanol in die Lösung geben und kurz vortexen. Aufschlusspuffer (50 mM TEAB), 1 mlFügen Sie 50 μl 1 M TEAB hinzu und füllen Sie bis zu 1 ml mit deionisiertem Wasser auf. 200 mM Dithiothreitol (DTT)-Lösung, 500 μl15 mg DTT abwiegen und in 500 μl deionisiertem Wasser auflösen; Vortex kurz.HINWEIS: Vor Gebrauch vorbereiten. 400 mM Jodacetamid (IAA)-Lösung, 200 μl15 mg IAA wiegen und in 200 μl deionisiertem Wasser auflösen; Vortex kurz. HINWEIS: Vor Gebrauch vorbereiten und Licht vermeiden. 0,2 % Ameisensäure, 50 % Acetonitril, 10 mlBereiten Sie 10 ml 50%iges Acetonitril in deionisiertem Wasser vor. 20 μl Ameisensäure zugeben und kurz vortexen. 0,2%ige Ameisensäurelösung, 10 ml20 μl Ameisensäure zu 10 mL entionisiertem Wasser geben und kurz vortexen. 0,1%ige Ameisensäurelösung, 10 ml10 μl Ameisensäure zu 10 ml deionisiertem Wasser geben; Vortex kurz. 3. Proteinextraktion im Schirmer-Streifen Schneiden Sie das vordere Ende über die 0-mm-Markierung des Streifens hinaus ab und entsorgen Sie es, um mögliche Verunreinigungen durch den Kontakt des Bindehautgewebes mit einer sauberen Edelstahlschere zu entfernen. Schneiden Sie den Streifen in 1-mm-Schritten in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Abbildung 3). 100 μl Lysepuffer in das Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei 1.000 U/min bei Raumtemperatur 1 h in einem Thermomixer vortexen. Kurz zentrifugieren und den Überstand in ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Führen Sie die Streifen mit einer sauberen Pinzette in 200-μl-Pipettenspitzen ein. Setzen Sie die Spitzen in dasselbe Röhrchen aus Schritt 3.4 mit Halter und zentrifugieren Sie sie bei Raumtemperatur bei 4.000 × g für 1 Minute weiter, um eine maximale Rückgewinnung der verbleibenden Probe auf dem Streifen zu erzielen. Messen Sie die Proteinkonzentration mit Bicinchoninsäure (BCA) oder einem kompatiblen Proteinassay. 4. Vorbereitung der Probenvorbereitung durch Suspensionsabscheidung Normalisieren Sie die Proben auf 50 μg Protein basierend auf dem Ergebnis des Proteinassays. 200 mM DTT im Verhältnis 1:10 (v/v, DVB-T: Probe) zu einer Endkonzentration von 20 mM DTT zugeben und bei 95 °C für 10 min inkubieren. Die Proteinlösung auf Raumtemperatur abkühlen lassen. 400 mM IAA im Verhältnis 1:10 (v/v, IAA: Probe) zu einer Endkonzentration von 40 mM IAA zugeben und 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. 12%ige wässrige Phosphorsäure im Verhältnis 1:10 (v/v, Säure: Probe) zu einer Endkonzentration von 1,2%iger Phosphorsäure zugeben und kurz vortexen. Proteinbindungspuffer im Verhältnis 1:6 zugeben (v/v, Probe: Puffer) und kurz vortexen.HINWEIS: In diesem Schritt sollte kolloidaler Proteinpartikel gebildet werden, und die Lösung erscheint durchscheinend, wenn die Proteinmenge ausreichend ist. Öffnen Sie die Kappe der Suspension Trapping Micro Spin Column und montieren Sie die Spin-Säule auf ein 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen, um den Durchfluss zu sammeln. Geben Sie bis zu 200 μl angesäuertes Proteinlysat-Gemisch in die Säule. Zentrifugieren Sie die Säule bei 4.000 × g für 20 s. Proteinpartikel wurden eingefangen; Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Proben in die Säule geladen sind. Fügen Sie 150 μl Proteinbindungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie 20 s lang bei 4.000 × g , um das suspendierte Protein zu waschen. 3x wiederholen. Montieren Sie die Suspensions-Trapping-Mikrosäule auf ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 20 μl 50 mM TEAB-Aufschlusspuffer, der Protease in einem Verhältnis von 1:25 (w/w, Trypsin: Protein) enthält, auf den Filter in der Schleudersäule und vermeiden Sie dabei Blasen und Luftspalte zwischen Filter und Aufschlusslösung. Verschließen Sie die Suspension Trapping Micro Spin Column, um Verdunstung zu verhindern. Bei 47 °C für 1 h in einem Thermomischer inkubieren; Während der Verdauung nicht schütteln oder wirbeln. Eluieren Sie Peptide mit 40 μl 50 mM TEAB durch Zentrifugalkraft bei 4.000 × g für 20 s. 40 μl 0,2 % FA zugeben und bei 4.000 × g 20 s zentrifugieren. Fügen Sie 35 μl 0,2 % FA und 50 % Acetonitril hinzu und zentrifugieren Sie 20 s lang bei 4.000 × g . Pool drei eluiert und trocknet mit einer Vakuumzentrifuge. Bis zur weiteren Analyse bei -80 °C Ultratiefkühlschrank lagern. HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. 5. Rekonstituieren von Peptiden für die massenspektrometrische Analyse Rekonstituieren Sie die Probe mit 12 μl 0,1 % FA, Wirbel und zentrifugieren Sie kurz. Messen Sie die Peptidkonzentration mit einem Peptid-Assay-Kit. Normalisieren Sie die Peptidkonzentration auf 0,5 μg/μl in 0,1 % FA. Füllen Sie die Peptidmischung in ein Autosampler-Fläschchen und bereiten Sie sie auf die massenspektrometrische Analyse vor. 6. Probenaufnahme mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie Laden Sie 3 μg des Peptids mit isokratischem Beladungspuffer (0,1 % FA, 5 % ACN) in eine Fallensäule (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) mit einer Flussrate von 2 μl/min für 15 min. Die Peptide werden mit einer Umkehrphasen-Nanoanalysesäule (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) bei einer Flussrate von 350 nL/min in einem 155-minütigen Trenngradienten fraktioniert. Verwenden Sie die mobile Phase A, die eine Mischung aus 0,1 % Ameisensäure (v/v), 5 % ACN (v/v) in Wasser enthält, und mobile Phase B mit 0,1 % FA (v/v), 98 % ACN (v/v) in Wasser. Verwenden Sie die folgende Steigung: 0-0,5 min: 5 % B, 0,5-90 min: 10 % B, 90-120 min: 20 % B, 120-130 min: 28 % B, 130-135 min: 45 % B, 135-141 min: 80 % B, 141-155 min: 5 % B. Führen Sie eine datenabhängige Erfassung (DDA) mit einem TOF-MS-Scanbereich zwischen 350 und 1800 m/z mit einer Akkumulationszeit von 250 ms und einer dynamischen Zielausschlusszeit von 18 s durch. Führen Sie dann einen MS/MS-Scan bei 100 bis 1.800 m/z im Hochempfindlichkeitsmodus mit einer Akkumulationszeit von 50 ms für die obersten 50 Vorläufer pro Zyklus mit einem Schwellenwert von 125 cps für MS/MS-Signale mit einem Ladezustand von +2 bis +4 durch. Analysieren Sie Rohdaten mit der referenzierten Software oder anderen kompatiblen Engines mit einer Referenzdatenbank in FASTA aus der öffentlich zugänglichen UniProt-Datenbank.