Préparation d’échantillons de piégeage de suspension de protéines pour la protéomique lacrymale par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem

Les sujets ont fourni un consentement éclairé écrit avant de participer à l’étude. L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique humaine de l’Université polytechnique de Hong Kong et a adhéré aux principes de la Déclaration d’Helsinki. 1. Collecte de liquide lacrymal humain avec une bandelette de Schirmer Portez des gants et désinfectez pour éviter la contamination de l’échantillon. Vérifiez que l’emballage intérieur est intact, stérile et non périmé. Pliez légèrement le haut de la bande Schirmer vers l’intérieur au repère 0 mm, comme indiqué près de l’extrémité en demi-cercle de la bande (Figure 1). Retirez la bandelette de l’emballage intérieur en tenant l’extrémité de la bandelette et évitez tout contact direct avec la zone de prélèvement de l’échantillon de 0 à 25 mm. Demandez au sujet de détourner le regard de la position de la bande à placer. Abaissez doucement la paupière inférieure et accrochez l’extrémité de la bandelette dans le fornix inférieur près de la région latérale du canthus (Figure 2). Répétez la même procédure sur l’autre œil. Demandez au sujet de fermer doucement les paupières pour minimiser l’irritation. Prélever du liquide lacrymal pendant environ 5 minutes ou, de préférence, un échantillon de larme de 15 à 20 mm a été prélevé. Demandez au sujet d’ouvrir les deux yeux, abaissez doucement la paupière inférieure et retirez les bandes du sujet. Inspectez la longueur hydratée sur la bande de Schirmer et notez la quantité collectée en mm. Séchez la bande avec un radiateur de cadre standard et propre jusqu’à ce que le liquide soit complètement sec.REMARQUE : Une chaleur excessive qui pourrait potentiellement carboniser le papier filtre doit être évitée. Insérez chaque bandelette de Schirmer séchée dans un cryotube étiqueté et conservez-la de préférence dans un endroit frais et sec à l’obscurité jusqu’à ce que le traitement se poursuive. 2. Préparation des produits chimiques et des réactifs Tampon de lyse (5 % SDS, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 mLPipeter 1 mL de TEAB 1 M et 80 μL d’acide phosphorique à 12 %. Vortex et sonique brièvement pour éliminer les bulles. Complétez jusqu’à 20 ml avec de l’eau déminéralisée. Peser 1 g de SDS et l’ajouter à la solution en oscillant jusqu’à dissolution. Tampon de précipitation protéique (90 % de méthanol, 100 mM de TEAB, pH 7,1), 10 mLAjouter 893 μL de TEAB 1 M et 92 μL d’eau déminéralisée. Ajouter 15 μL d’acide phosphorique à 85 % en poids et 9 mL de méthanol à la solution et au vortex brièvement. Tampon de digestion (50 mM TEAB), 1 mLAjouter 50 μL de TEAB 1 M et compléter jusqu’à 1 mL avec de l’eau déminéralisée. 200 mM de solution de dithiothréitol (DTT), 500 μLPeser 15 mg de DTT et dissoudre dans 500 μL d’eau déminéralisée ; vortex brièvement.REMARQUE : Préparer avant utilisation. Solution d’iodoacétamide (IAA) à 400 mM, 200 μLPeser 15 mg d’AIA et dissoudre dans 200 μL d’eau déminéralisée ; vortex brièvement. REMARQUE : Préparez avant utilisation et évitez la lumière. 0,2 % d’acide formique, 50 % d’acétonitrile, 10 mLPréparer 10 mL d’acétonitrile à 50 % dans de l’eau déminéralisée. Ajouter 20 μL d’acide formique et le vortex brièvement. Solution d’acide formique à 0,2 %, 10 mLAjouter 20 μL d’acide formique à 10 mL d’eau déminéralisée et tourbillonner brièvement. Solution d’acide formique à 0,1 %, 10 mLAjouter 10 μL d’acide formique à 10 mL d’eau déminéralisée ; vortex brièvement. 3. Extraction de protéines en bandelette de Schirmer Coupez et jetez l’extrémité avant au-delà de la marque 0 mm de la bande pour éliminer la contamination potentielle due au contact des tissus conjonctivaux avec des ciseaux en acier inoxydable propres. Coupez la bande par intervalles de 1 mm dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml (figure 3). Ajouter 100 μL de tampon de lyse dans le tube de microcentrifugation et le vortex à 1 000 tr/min, à température ambiante pendant 1 h dans un thermomélangeur. Centrifuger brièvement et transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Déplacez les bandelettes dans des pointes de pipette de 200 μL à l’aide d’une pince propre. Placez les embouts dans le même tube que celui de l’étape 3.4 avec support et centrifugez à température ambiante à 4 000 × g pendant 1 minute supplémentaire pour une récupération maximale de l’échantillon restant sur la bandelette. Mesurez la concentration en protéines à l’aide de l’acide bicinchoninique (BCA) ou d’un dosage de protéines compatibles. 4. Préparation de l’échantillon par piégeage en suspension Normaliser les échantillons à 50 μg de protéines en fonction du résultat de l’analyse des protéines. Ajouter 200 mM de TNT dans un rapport de 1 :10 (v/v, TNT : échantillon) à une concentration finale de 20 mM de TNT et incuber à 95 °C pendant 10 min. Refroidir la solution protéique à température ambiante. Ajouter 400 mM d’AIA dans un rapport de 1 :10 (v/v, IAA : échantillon) à une concentration finale de 40 mM d’AIA et incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 min. Ajouter 12 % d’acide phosphorique aqueux dans un rapport de 1 :10 (v/v, acide : échantillon) à une concentration finale de 1,2 % d’acide phosphorique et vortex brièvement. Ajouter le tampon de liaison aux protéines dans un rapport de 1 :6 (v/v, échantillon : tampon) et le vortex brièvement.REMARQUE : Dans cette étape, des particules de protéines colloïdales doivent être formées et la solution apparaîtra translucide si la quantité de protéines est suffisante. Décapsulez la colonne de micro-centrifugation de piégeage de suspension et assemblez la colonne de centrifugation sur un tube de microcentrifugation de 2 ml pour recueillir l’écoulement. Ajouter jusqu’à 200 μL de mélange de lysat de protéines acidifiées dans la colonne. Centrifuger la colonne à 4 000 × g pendant 20 s. Les particules de protéines ont été piégées ; Répétez l’opération jusqu’à ce que les échantillons soient chargés dans la colonne. Ajouter 150 μL de tampon de liaison protéique et centrifuger à 4 000 × g pendant 20 s pour laver la protéine en suspension. Répétez 3 fois. Assemblez la micro-colonne de piégeage de suspension sur un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 20 μL de tampon de digestion TEAB 50mM contenant de la protéase dans un rapport de 1 :25 (p/p, trypsine : protéine) sur le filtre à l’intérieur de la colonne de centrifugation, en évitant les bulles et l’espace d’air entre le filtre et la solution de digestion. Bouchez la colonne de micro-essorage de piégeage de la suspension pour éviter l’évaporation. Incuber à 47 °C pendant 1 h dans un thermomélangeur ; Ne pas secouer ou vortex pendant la digestion. Peptides élués avec 40 μL de 50 mM TEAB par force centrifuge à 4 000 × g pendant 20 s. Ajouter 40 μL d’AG à 0,2 % et centrifuger à 4 000 × g pendant 20 s. Ajouter 35 μL d’AG à 0,2 %, 50 % d’acétonitrile et centrifuger à 4 000 × g pendant 20 s. Mettez en piscine trois éluats et séchez-les à l’aide d’une centrifugeuse sous vide. Conserver au congélateur à ultra-basse température de -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. 5. Reconstituer les peptides pour l’analyse par spectrométrie de masse Reconstituer l’échantillon avec 12 μL d’AG à 0,1 %, vortex et centrifuger brièvement. Mesurez la concentration peptidique à l’aide d’un kit de dosage peptidique. Normaliser la concentration peptidique à 0,5 μg/μL dans 0,1 % d’AG. Transférez le mélange peptidique dans un flacon d’échantillonneur automatique et préparez-le pour l’analyse par spectrométrie de masse. 6. Acquisition d’échantillons par chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse en tandem Charger 3 μg du peptide avec tampon de charge isocratique (0,1 % FA, 5 % ACN) dans une colonne piège (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) à un débit de 2 μL/min pendant 15 min. Fractionner les peptides à l’aide d’une nano colonne analytique en phase inverse (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) à un débit de 350 nL/min dans un gradient de séparation de 155 min. Utiliser la phase mobile A comprenant un mélange de 0,1 % d’acide formique (v/v), 5 % d’ACN (v/v) dans l’eau et la phase mobile B contenant 0,1 % d’AG (v/v), 98 % d’ACN (v/v) dans l’eau. Utilisez le gradient suivant : 0-0,5 min : 5 % B, 0,5-90 min : 10 % B, 90-120 min : 20 % B, 120-130 min : 28 % B, 130-135 min : 45 % B, 135-141 min : 80 % B, 141-155 min : 5 % B. Effectuez une acquisition dépendante des données (DDA) avec une plage de balayage TOF-MS comprise entre 350 et 1800 m/z avec un temps d’accumulation de 250 ms et un temps d’exclusion dynamique de la cible de 18 s. Ensuite, effectuez un balayage MS/MS à 100 à 1 800 m/z en mode haute sensibilité avec un temps d’accumulation de 50 ms pour les 50 premiers précurseurs par cycle avec un seuil de 125 cps pour un signal MS/MS avec un état de charge de +2 à +4. Analysez les données brutes à l’aide du logiciel référencé ou d’autres moteurs compatibles avec une base de données de référence en FASTA à partir de la base de données UniProt accessible au public.