Een monstervoorbereiding voor het vangen van eiwitten voor traanproteomics door middel van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie

Proefpersonen gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan deelname aan het onderzoek. De studie werd goedgekeurd door de Human Ethics Committee van de Hong Kong Polytechnic University en voldeed aan de principes van de Verklaring van Helsinki. 1. Afname van menselijk traanvocht met Schirmer-strip Draag handschoenen en ontsmet om besmetting van het monster te voorkomen. Controleer of de binnenverpakking intact, steriel en niet verlopen is. Buig de bovenkant van de Schirmer-strip iets naar binnen bij de 0 mm-markering, zoals aangegeven bij de halve cirkelpunt van de strip (Figuur 1). Verwijder de strip uit de binnenverpakking door het uiteinde van de strip vast te houden en vermijd direct contact met het monsterafnamegebied van 0 tot 25 mm. Vraag de proefpersoon om weg te kijken van de positie van de te plaatsen strip. Trek het onderste ooglid voorzichtig naar beneden en haak het uiteinde van de strip in de onderste fornix bij het laterale canthusgebied (Figuur 2). Herhaal dezelfde procedure op het andere oog. Vraag de proefpersoon om de oogleden voorzichtig te sluiten om irritatie tot een minimum te beperken. Verzamel traanvocht gedurende ongeveer 5 minuten of bij voorkeur 15-20 mm traanmonster werd verzameld. Vraag de proefpersoon om beide ogen te openen, trek het onderste ooglid voorzichtig naar beneden en verwijder de strips van het onderwerp. Inspecteer de gehydrateerde lengte op de Schirmer-strip en noteer de verzamelde hoeveelheid in mm. Droog de strip met een standaard, schone frameverwarming totdat de vloeistof volledig droog is.NOTITIE: Overmatige verhitting die het filterpapier mogelijk zou kunnen verkolen, moet worden vermeden. Plaats elke gedroogde Schirmer-strip in een gelabelde cryobuis en bewaar deze bij voorkeur op een koele, droge plaats in het donker tot verdere verwerking. 2. Bereiding van chemicaliën en reagentia Lysisbuffer (5% SDS, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 mlPipetteer 1 ml 1 M TEAB en 80 μl 12% fosforzuur. Draai en sonicaat kort om luchtbellen te verwijderen. Vul tot 20 ml aan met gedeïoniseerd water. Weeg 1 g SDS af en voeg oscillerend toe aan de oplossing tot het is opgelost. Eiwitneerslagbuffer (90% methanol, 100 mM TEAB, pH 7,1), 10 mlVoeg 893 μL 1 M TEAB en 92 μL gedeïoniseerd water toe. Voeg 15 μl fosforzuur van 85 gew.% fosforzuur en 9 ml methanol toe aan de oplossing en draai kort. Spijsverteringsbuffer (50 mM TEAB), 1 mlVoeg 50 μL 1 M TEAB toe en vul aan tot 1 ml met gedeïoniseerd water. 200 mM dithiothreitol (DTT) oplossing, 500 μLWeeg 15 mg DTT af en los op in 500 μL gedeïoniseerd water; vortex kort.NOTITIE: Voorbereiden voor gebruik. 400 mM jodoacetamide (IAZ) oplossing, 200 μLWeeg 15 mg IAZ af en los op in 200 μL gedeïoniseerd water; vortex kort. NOTITIE: Bereid voor gebruik voor en vermijd licht. 0,2% mierenzuur, 50% acetonitril, 10 mlBereid 10 ml 50% acetonitril in gedeïoniseerd water. Voeg 20 μL mierenzuur toe en draai kort. 0,2% mierenzuuroplossing, 10 mlVoeg 20 μL mierenzuur toe aan 10 ml gedeïoniseerd water en draai kort. 0,1% mierenzuuroplossing, 10 mlVoeg 10 μL mierenzuur toe aan 10 ml gedeïoniseerd water; vortex kort. 3. Eiwitextractie in Schirmerband Knip en gooi het voorste uiteinde voorbij de 0 mm-markering van de strip weg om mogelijke verontreiniging door het contact van conjunctivale weefsels met een schone roestvrijstalen schaar te verwijderen. Snijd de strip in tussenpozen van 1 mm in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml (figuur 3). Voeg 100 μL lysisbuffer toe aan de microcentrifugebuis en draai bij 1.000 tpm, kamertemperatuur gedurende 1 uur in een thermomixer. Centrifugeer kort en breng het supernatans over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Verplaats de strips met een schone pincet in pipetpunten van 200 μl. Plaats de tips in hetzelfde buisje uit stap 3.4 met houder en centrifugeer bij kamertemperatuur bij 4.000 × g gedurende 1 minuut verder voor maximale opvang van het resterende monster op de strip. Meet de eiwitconcentratie met behulp van bicinchoninezuur (BCA) of een compatibele eiwittest. 4. Monstervoorbereiding met suspensie-vanger Normaliseer monsters tot 50 μg eiwit op basis van het resultaat van de eiwittest. Voeg 200 mM DTT in een verhouding van 1:10 (v/v, DTT: monster) toe tot een eindconcentratie van 20 mM DTT en incubeer gedurende 10 minuten bij 95 °C. Koel de eiwitoplossing af tot kamertemperatuur. Voeg 400 mM IAZ toe in een verhouding van 1:10 (v/v, IAZ: monster) tot een eindconcentratie van 40 mM IAZ en incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Voeg 12% waterig fosforzuur toe in een verhouding van 1:10 (v/v, zuur: monster) tot een eindconcentratie van 1,2% fosforzuur en draai kort. Voeg eiwitbindende buffer toe in een verhouding van 1:6 (v/v, monster: buffer) en draai kort.OPMERKING: In deze stap moet colloïdaal eiwitdeeltje worden gevormd en zal de oplossing doorschijnend lijken als de hoeveelheid eiwit voldoende is. Maak de dop van de Suspension Trapping Micro Spin Column los en monteer de spinkolom op een microcentrifugebuis van 2 ml om de doorstroming op te vangen. Voeg maximaal 200 μL aangezuurd eiwitlysaatmengsel toe aan de kolom. Centrifugeer de kolom bij 4.000 × g gedurende 20 s. Eiwitdeeltjes werden opgesloten; Herhaal dit totdat de monsters in de kolom zijn geladen. Voeg 150 μL eiwitbindingsbuffer toe en centrifugeer gedurende 20 s bij 4.000 × g om het gesuspendeerde eiwit te wassen. Herhaal 3x. Monteer de Suspension Trapping Micro Column op een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 20 μL 50mM TEAB-digestiebuffer met protease in een verhouding van 1:25 (m/g, trypsine: eiwit) toe aan het filter in de spinkolom, vermijd luchtbellen en luchtspleet tussen het filter en de digestieoplossing. Sluit de Suspension Trapping Micro Spin Column af om verdamping te voorkomen. Incubeer bij 47 °C gedurende 1 uur in een thermomixer; Niet schudden of wervelen tijdens de spijsvertering. Elute peptiden met 40 μL 50 mM TEAB door middelpuntvliedende kracht bij 4.000 × g gedurende 20 s. Voeg 40 μl 0,2% FA toe en centrifugeer gedurende 20 s bij 4.000 × g . Voeg 35 μl 0,2% FA, 50% acetonitril toe en centrifugeer gedurende 20 s bij 4.000 × g . Pool drie eluates en droog met een vacuümcentrifuge. Bewaren bij -80 °C ultra-lage temperatuur vriezer tot verdere analyse. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. 5. Reconstitueer peptiden voor massaspectrometrie-analyse Reconstitueer het monster met 12 μL 0,1% FA, vortex en centrifugeer kort. Meet de peptideconcentratie met een Peptide Assay Kit. Normaliseer de peptideconcentratie tot 0,5 μg/μL in 0,1% FA. Breng het peptidemengsel over in een autosampler-flacon en klaar voor massaspectrometrie-analyse. 6. Monsterverwerving door vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie Laad 3 μg van het peptide met isocratische laadbuffer (0,1% FA, 5% ACN) in een valkolom (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) met een stroomsnelheid van 2 μL/min gedurende 15 min. Fractioneer de peptiden met behulp van een omgekeerde fase nano-analytische kolom (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) met een stroomsnelheid van 350 nL/min in een scheidingsgradiënt van 155 minuten. Gebruik mobiele fase A bestaande uit een mengsel van 0,1% mierenzuur (v/v), 5% ACN (v/v) in water en mobiele fase B met 0,1% FA (v/v), 98% ACN (v/v) in water. Gebruik de volgende gradiënt: 0-0,5 min: 5% B, 0,5-90 min: 10% B, 90-120 min: 20% B, 120-130 min: 28% B, 130-135 min: 45% B, 135-141 min: 80% B, 141-155 min: 5% B. Voer data-afhankelijke acquisitie (DDA) uit met een TOF-MS-scanbereik tussen 350 en 1800 m/z met een accumulatietijd van 250 ms en een dynamische doeluitsluitingstijd van 18 s. Voer vervolgens een MS/MS-scan uit met een snelheid van 100 tot 1.800 m/z in de modus met hoge gevoeligheid met een accumulatietijd van 50 ms voor de top 50 precursoren per cyclus met een drempel van 125 cps voor MS/MS-signaal met een laadtoestand van +2 tot +4. Analyseer ruwe gegevens met de software waarnaar wordt verwezen of andere compatibele engines met een referentiedatabase in FASTA uit de openbaar toegankelijke UniProt-database.