液体クロマトグラフィータンデム質量分析による涙液プロテオミクスのためのタンパク質懸濁液トラップサンプル調製

被験者は、研究に参加する前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。この研究は、香港理工大学の人間倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言の原則を遵守しました。 1. シルマーストリップによるヒト涙液の採取 サンプルの汚染を避けるために、手袋を着用し、消毒してください。 内側のパッケージが無傷で、滅菌済みで、有効期限が切れていないことを確認してください。 シルマーストリップの上部を、ストリップの半円の先端付近に示されているように、0mmのマークでわずかに内側に曲げます(図1)。 ストリップの端を持ってストリップを内側のパッケージから取り出し、0〜25mmのサンプル収集領域に直接接触しないようにします。 被写体に、配置するストリップの位置から目をそらすように指示します。 下まぶたを静かに引き下げ、ストリップの端を外側眼窩領域近くの下部円蓋に引っ掛けます(図2)。もう一方の目も同じ手順を繰り返します。 刺激を最小限に抑えるために、被験者にまぶたをそっと閉じるように依頼します。 約5分間、または好ましくは15〜20mmの涙液を採取し、涙液サンプルを採取した。 被験者に両目を開けてもらい、下まぶたをそっと引き下げて、被験者からストリップを取り除きます。 シルマーストリップの水和長さを検査し、収集量をmm単位で記録します。 液体が完全に乾くまで、標準の清潔なフレームヒーターでストリップを乾かします。注意: ろ紙を焦がす可能性のある過度の加熱は避けてください。 乾燥した各シルマーストリップをラベル付きのクライオチューブに挿入し、さらに処理するまで暗所の涼しく乾燥した場所に保管してください。 2. 薬品・試薬の調製 溶解バッファー(5% SDS、50 mM TEAB、pH 7.5)、20 mL1 mL の 1 M TEAB と 80 μL の 12% リン酸をピペットでつなぎます。ボルテックスと超音波処理を短時間行い、気泡を除去します。最大20 mLに脱イオン水を補充します。 1 g の SDS を秤量し、溶解するまで振動しながら溶液に加えます。 タンパク質沈殿バッファー(90%メタノール、100 mM TEAB、pH 7.1)、10 mL893 μL の 1 M TEAB と 92 μL の脱イオン水を加えます。 15 μL の 85 wt. % リン酸と 9 mL のメタノールを溶液に加え、短時間ボルテックスします。 消化バッファー(50 mM TEAB)、1 mL50 μL の 1 M TEAB を加え、1 mL まで脱イオン水を補充します。 200 mM ジチオスレイトール(DTT)溶液、500 μL15 mgのDTTを秤量し、500 μLの脱イオン水に溶解します。ボルテックスを簡潔に。注意: 使用前に準備してください。 400 mM ヨードアセトアミド(IAA)溶液、200 μL15 mg の IAA を秤量し、200 μL の脱イオン水に溶解します。ボルテックスを簡潔に。注意: 使用前に準備し、光を避けてください。 0.2% ギ酸, 50% アセトニトリル, 10 mL脱イオン水に 50% アセトニトリル 10 mL を調製します。 20 μLのギ酸を加え、短時間ボルテックスします。 0.2% ギ酸溶液、10 mL20 μLのギ酸を10 mLの脱イオン水に加え、短時間ボルテックスします。 0.1% ギ酸溶液、10 mL10 mLの脱イオン水に10 μLのギ酸を加えます。ボルテックスを簡潔に。 3. シルマーストリップでのタンパク質抽出 ストリップの0mmマークを超えて前端を切断して廃棄し、結膜組織と清潔なステンレス鋼のはさみとの接触による潜在的な汚染を取り除きます。 ストリップを1mm間隔でカットし、1.5 mLの微量遠心チューブに入れます(図3)。 100 μLの溶解バッファーを微量遠心チューブに加え、1,000rpm、室温でサーモミキサーで1時間ボルテックスします。 短時間遠心分離し、上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。 清潔な鉗子を使用して、ストリップを200 μLのピペットチップに移します。チップをホルダー付きでステップ3.4と同じチューブに入れ、室温で4,000 × g でさらに1分間遠心分離し、ストリップ上の残りのサンプルを最大限回収します。 ビシンコニン酸(BCA)または適合性タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定します。 4. 懸濁液捕捉サンプル調製 タンパク質アッセイ結果に基づいて、サンプルを 50 μg のタンパク質に正規化します。 200 mM DTT を 1:10 (v/v、DTT: サンプル) の比率で添加し、最終濃度 20 mM DTT になるようにし、95 °C で 10 分間インキュベートします。 タンパク質溶液を室温まで冷却します。 400 mM IAA を 1:10 の比率で添加し(v/v、IAA: サンプル)、最終濃度 40 mM IAA とし、暗所で室温で 10 分間インキュベートします。 12%リン酸水溶液を1:10(v/v、酸:サンプル)の比率で加え、最終濃度が1.2%のリン酸になるようにし、短時間ボルテックスします。 タンパク質結合バッファーを1:6の比率で添加し(v/v、サンプル:バッファー)、短時間ボルテックスします。注:このステップでは、コロイド状のタンパク質粒子が形成され、タンパク質量が十分な場合、溶液は半透明に見えます。 懸濁液トラッピングマイクロスピンカラムのキャップを外し、スピンカラムを 2 mL の微量遠心チューブに組み立ててフロースルーを回収します。 最大 200 μL の酸性タンパク質ライセート混合物をカラムに添加します。 カラムを 4,000 × g で 20 秒間遠心分離します。タンパク質微粒子が捕捉されました。サンプルがカラムにロードされるまで繰り返します。 タンパク質結合バッファー150 μLを添加し、4,000 × g で20秒間遠心分離して、懸濁タンパク質を洗浄します。これを3回繰り返します。 懸濁液トラップマイクロカラムを新しい 1.5 mL 微量遠心チューブに組み立てます。 プロテアーゼを含む50 mM TEAB消化バッファー20 μLを1:25(w/w、トリプシン:タンパク質)の比率でスピンカラム内のフィルターに添加し、フィルターと消化溶液の間に気泡やエアギャップが生じないようにします。 懸濁液トラップマイクロスピンカラムにキャップをして、蒸発を防ぎます。サーモミキサーで47°Cで1時間インキュベートします。消化中に振ったり渦を巻いたりしないでください。 40 μL の 50 mM TEAB で、4,000 × g の遠心力で 20 秒間ペプチドを溶出します。 40 μL の 0.2% FA を加え、4,000 × g で 20 秒間遠心分離します。 35 μL の 0.2% FA、50% アセトニトリルを加え、4,000 × g で 20 秒間遠心分離します。 3つの溶出液をプールし、真空遠心分離機で乾燥させます。 さらに分析するまで、-80°Cの超低温冷凍庫で保管してください。注: プロトコルはここで一時停止できます。 5. 質量分析のためのペプチドの再構成 12 μL の 0.1% FA でサンプルを再溶解し、ボルテックスし、遠心分離機に短時間かけます。 ペプチドアッセイキットでペプチド濃度を測定します。 ペプチド濃度を 0.1% FA で 0.5 μg/μL に正規化します。 ペプチド混合物をオートサンプラーバイアルに移し、質量分析の準備を整えます。 6. 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析によるサンプル取得 3 μgのペプチドをアイソクラティックローディングバッファー(0.1% FA、5% ACN)とともにトラップカラム(C18、5 μm、100 μm、20 mm)に流速2 μL/分で15分間ロードします。 逆相ナノ分析カラム(C18、5 μm、100 μm、300 mm)を使用して、流速350 nL/分、155分の分離グラジエントでペプチドを分画します。0.1% ギ酸(v/v)、5% ACN(v/v)の混合液を含む移動相 A と、水中に 0.1% FA(v/v)、98% ACN(v/v)を含む移動相 B を使用します。0-0.5分:5%B、0.5-90分:10%B、90-120分:20%B、120-130分:28%B、130-135分:45%B、135-141分:80%B、141-155分:5%B。 350 〜 1800 m/z の TOF-MS スキャン範囲で、累積時間 250 ms、動的ターゲット除外時間 18 秒でデータ依存性取得 (DDA) を実行します。次に、100 から 1,800 m/z の高感度モードで、上位 50 の前駆体に対して 50 ミリ秒の累積時間、+2 から +4 の充電状態の MS/MS シグナルに対して 125 cps のしきい値で MS/MS スキャンを実行します。 一般にアクセス可能なUniProtデータベースからFASTAのリファレンスデータベースを使用して、参照ソフトウェアまたはその他の互換性のあるエンジンを使用して生データを分析します。