Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi ile Gözyaşı Proteomiği için Bir Protein Süspansiyonu-Tutucu Numune Hazırlama

Denekler çalışmaya katılmadan önce yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Çalışma, Hong Kong Politeknik Üniversitesi İnsan Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Helsinki Bildirgesi’nin ilkelerine bağlı kaldı. 1. İnsan gözyaşı sıvısının Schirmer şeridi ile toplanması Numune kontaminasyonunu önlemek için eldiven giyin ve sterilize edin. İç ambalajın sağlam, steril ve son kullanma tarihinin geçmemiş olduğunu kontrol edin. Schirmer şeridinin üst kısmını, şeridin yarım daire ucunun yanında gösterildiği gibi 0 mm işaretinde hafifçe içe doğru bükün (Şekil 1). Şeridin ucunu tutarak şeridi iç ambalajdan çıkarın ve 0 ila 25 mm arasındaki numune toplama alanıyla doğrudan temastan kaçının. Denekten yerleştirilecek şeridin konumundan başka bir yere bakmasını isteyin. Alt göz kapağını yavaşça aşağı çekin ve şeridin ucunu lateral kantus bölgesinin yakınındaki alt fornikse asın (Şekil 2). Aynı işlemi diğer gözde de tekrarlayın. Tahrişi en aza indirmek için denekten göz kapaklarını nazikçe kapatmasını isteyin. Yaklaşık 5 dakika boyunca gözyaşı sıvısı toplandı veya tercihen 15-20 mm gözyaşı örneği alındı. Denekten her iki gözünü de açmasını, alt göz kapağını nazikçe aşağı çekmesini ve şeritleri konudan çıkarmasını isteyin. Schirmer şeridindeki hidratlı uzunluğu inceleyin ve toplanan miktarı mm cinsinden kaydedin. Sıvı tamamen kuruyana kadar şeridi standart, temiz bir çerçeve ısıtıcısıyla kurutun.NOT: Filtre kağıdını kömürleştirebilecek aşırı ısınmadan kaçınılmalıdır. Her kurutulmuş Schirmer şeridini etiketli bir kriyotüpe yerleştirin ve daha fazla işleme kadar tercihen karanlıkta serin ve kuru bir yerde saklayın. 2. Kimyasalların ve reaktiflerin hazırlanması Lizis Tamponu (%5 SDS, 50 mM TEAB, pH 7.5), 20 mL1 mL 1 M TEAB ve 80 μL fosforik asit pipetleyin. Kabarcıkları çıkarmak için kısaca girdap ve sonikate. Deiyonize su ile 20 mL’ye kadar doldurun. 1 g SDS tartın ve çözünene kadar salınımlı çözeltiye ekleyin. Protein Çökeltme Tamponu ( metanol, 100 mM TEAB, pH 7.1), 10 mL893 μL 1 M TEAB ve 92 μL deiyonize su ekleyin. Çözeltiye ağırlıkça 15 μL fosforik asit ve 9 mL metanol ekleyin ve kısaca girdap yapın. Sindirim Tamponu (50 mM TEAB), 1 mL50 μL 1 M TEAB ekleyin ve 1 mL’ye kadar deiyonize su ekleyin. 200 mM ditiyotreitol (DTT) çözeltisi, 500 μL15 mg DTT tartılır ve 500 μL deiyonize suda çözülür; kısaca girdap.NOT: Kullanmadan önce hazırlayın. 400 mM iyodoasetamid (IAA) çözeltisi, 200 μL15 mg IAA ağırlığında ve 200 μL deiyonize suda çözülür; kısaca girdap. NOT: Kullanmadan önce hazırlayın ve ışıktan kaçının. %0,2 formik asit, asetonitril, 10 mLDeiyonize suda 10 mL asetonitril hazırlayın. 20 μL formik asit ekleyin ve kısaca girdap yapın. % 0.2 formik asit çözeltisi, 10 mL10 mL deiyonize suya 20 μL formik asit ekleyin ve kısaca girdap yapın. % 0.1 formik asit çözeltisi, 10 mL10 mL deiyonize suya 10 μL formik asit ekleyin; kısaca girdap. 3. Schirmer şeridinde protein ekstraksiyonu Konjonktival dokuların temiz paslanmaz çelik makasla temasından kaynaklanan olası kontaminasyonu gidermek için ön ucu şeridin 0 mm işaretinin ötesinde kesin ve atın. Şeridi 1 mm aralıklarla 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne kesin (Şekil 3). Mikrosantrifüj tüpüne 100 μL lizis tamponu ekleyin ve bir termomikserde 1 saat oda sıcaklığında 1.000 rpm’de girdap yapın. Kısa bir süre santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Şeritleri temiz forseps kullanarak 200 μL’lik pipet uçlarına taşıyın. Uçları tutucu ile adım 3.4’ten itibaren aynı tüpe yerleştirin ve şerit üzerinde kalan numunenin maksimum geri kazanımı için 4.000 × g’da oda sıcaklığında 1 dakika daha santrifüjleyin. Bikinkoninik asit (BCA) veya uyumlu protein tahlili kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün. 4. Süspansiyon tutucu numune hazırlama Protein tahlili sonucuna göre numuneleri 50 μg proteine normalleştirin. 20 mM DTT’lik bir nihai konsantrasyona 1:10 oranında 200 mM DTT (v/h, DTT: numune) ekleyin ve 95 °C’de 10 dakika inkübe edin. Protein çözeltisini oda sıcaklığına soğutun. 40 mM IAA’lık bir nihai konsantrasyona 1:10 oranında (h/h, IAA: numune) 400 mM IAA ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. %1.2 fosforik asidin nihai konsantrasyonuna 1:10 (h/h, asit: numune) oranında sulu fosforik asit ekleyin ve kısaca girdap yapın. 1:6 oranında protein bağlayıcı tampon ekleyin (v/h, örnek: tampon) ve kısaca girdap yapın.NOT: Bu adımda, kolloidal protein partikülü oluşturulmalıdır ve protein miktarı yeterliyse çözelti yarı saydam görünecektir. Süspansiyon Tutucu Mikro Döndürme Kolonu kapağını açın ve akışı toplamak için döndürme kolonunu 2 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne monte edin. Kolona 200 μL’ye kadar asitlendirilmiş protein lizat karışımı ekleyin. Kolonu 20 saniye boyunca 4.000 × g’da santrifüjleyin. Protein partikülleri hapsedildi; Örnekler sütuna yüklenene kadar tekrarlayın. 150 μL protein bağlayıcı tampon ekleyin ve askıdaki proteini yıkamak için 20 saniye boyunca 4.000 × g’da santrifüjleyin. 3x tekrarlayın. Süspansiyon Tutucu Mikro Kolonu yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne monte edin. Spin kolonunun içindeki filtreye 1:25 oranında proteaz içeren 20 μL 50mM TEAB sindirim tamponu ekleyin (a/a, tripsin: protein) filtre ile sindirim solüsyonu arasındaki kabarcıkları ve hava boşluğunu önleyin. Buharlaşmayı önlemek için Süspansiyon Tutucu Mikro Döndürme Sütununu kapatın. Bir termomikserde 47 °C’de 1 saat inkübe edin; Sindirim sırasında sallamayın veya girdap yapmayın. 20 saniye boyunca 4.000 × g’da merkezkaç kuvveti ile 40 μL 50 mM TEAB ile elute peptitler. 40 μL% 0.2 FA ekleyin ve 20 saniye boyunca 4.000 × g’da santrifüjleyin. 35 μL %0.2 FA, asetonitril ekleyin ve 20 saniye boyunca 4.000 × g’da santrifüjleyin. Havuz üç elüasyon yapar ve bir vakum santrifüjü ile kurutur. Daha fazla analize kadar -80 °C ultra düşük sıcaklıktaki dondurucuda saklayın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. 5. Kütle spektrometrisi analizi için peptitleri sulandırın Numuneyi 12 μL% 0.1 FA, vorteks ve santrifüj ile kısaca sulandırın. Peptit konsantrasyonunu bir Peptit Test Kiti ile ölçün. Peptit konsantrasyonunu% 0.1 FA’da 0.5 μg / μL’ye normalleştirin. Peptit karışımını bir otomatik örnekleyici şişesine aktarın ve kütle spektrometrisi analizi için hazır hale getirin. 6. Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi ile Numune Alımı İzokratik yükleme tamponu (% 0.1 FA,% 5 ACN) ile 3 μg peptidi, 15 dakika boyunca 2 μL / dak’lık bir akış hızında bir tuzak kolonuna (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) yükleyin. Peptitleri, 155 dakikalık bir ayırma gradyanında 350 nL / dak’lık bir akış hızında ters fazlı bir nano analitik kolon (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) kullanarak fraksiyonlayın. Suda %0,1 formik asit (h/v), %5 ACN (h/v) karışımından oluşan mobil faz A ve suda %0,1 FA (h/v), ACN (h/v) içeren mobil faz B kullanın. Aşağıdaki gradyanı kullanın: 0-0,5 dk: %5 B, 0,5-90 dk: B, 90-120 dk: B, 120-130 dk: B, 130-135 dk: B, 135-141 dk: B, 141-155 dk: %5 B. 350 ila 1800 m/z arasında bir TOF-MS tarama aralığıyla, 250 ms’lik bir biriktirme süresi ve 18 s’lik bir dinamik hedef dışlama süresiyle veriye bağlı toplama (DDA) gerçekleştirin. Ardından, +2 ila +4 arasında bir şarj durumuna sahip MS/MS sinyali için 125 cps eşiği ile döngü başına ilk 50 öncü için 50 ms’lik bir biriktirme süresiyle yüksek hassasiyet modunda 100 ila 1.800 m/z’de bir MS/MS taraması gerçekleştirin. Ham verileri, referans verilen yazılımla veya diğer uyumlu motorlarla genel olarak erişilebilen UniProt veritabanından FASTA’daki bir referans veritabanıyla analiz edin.